生物起搏中的病毒載體

張健 綜述 黃從新 審校

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060)

心臟生物起搏是指通過利用基因過表達(dá)、基因抑制、干細(xì)胞基因修飾等相關(guān)技術(shù)對機(jī)體受損的自律性節(jié)律點(diǎn)或傳導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，從而構(gòu)建一個(gè)“生物起搏器”，使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù)，從心臟的生理功能和人體適應(yīng)性的角度，避免了傳統(tǒng)電子起搏器的缺陷和嚴(yán)重并發(fā)癥，是更理想的治療方式[1]?；蛑委熓菢?gòu)建“生物起搏器”的有效方法，即將目的基因?qū)胧軗p的自律性節(jié)律點(diǎn)或傳導(dǎo)系統(tǒng)的靶細(xì)胞中，通過導(dǎo)入目的基因表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)或抑制體內(nèi)某基因的表達(dá)，從而達(dá)到恢復(fù)心臟起搏或傳導(dǎo)功能的目的[2]。而通過病毒載體進(jìn)行有效的基因轉(zhuǎn)染是基因治療的先決條件。良好的病毒載體系統(tǒng)必須具備三要素[3]：安全性(病毒基因組的拆分與去除)、轉(zhuǎn)導(dǎo)高效性和相對特異性(受體-配體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)染)、基因組類型與宿主依賴性(不同病毒的感染表達(dá)特性與應(yīng)用)。雖然現(xiàn)今所用的病毒載體有不錯(cuò)的效果，但均存在一定的局限性，現(xiàn)就當(dāng)前生物起搏研究所涉及的病毒載體做一綜述。

1 生物起搏中常用病毒載體的結(jié)構(gòu)特性

病毒宿主范圍廣，可以高效轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞，幾乎適用于所有細(xì)胞系、原代細(xì)胞和部分組織，因此作為基因治療的有利工具，廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療；但病毒是病原體，在利用病毒時(shí)，通常去除其中多個(gè)和病毒活性相關(guān)的序列結(jié)構(gòu)，再引入實(shí)驗(yàn)所需要的目的基因的序列和表達(dá)結(jié)構(gòu)，而制備出具有感染力的病毒，通過感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)目的基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。目前生物起搏中常用的病毒是慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV )(見表1)。

1.1 慢病毒

表1 不同病毒載體的主要特性

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，由兩條相同的正鏈RNA組成的有包膜的球形病毒，通過DNA中間體復(fù)制，并與宿主細(xì)胞的染色體隨機(jī)整合?，F(xiàn)應(yīng)用最廣泛的慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。其主要優(yōu)勢如下[4-5]：(1)慢病毒載體系統(tǒng)宿主范圍廣，能夠有效感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞；(2)慢病毒載體能承載不超過4 kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低；(3)慢病毒能隨機(jī)整合至宿主染色體上并對轉(zhuǎn)錄沉默作用有一定的抵抗力，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，持續(xù)高水平表達(dá)；(4)慢病毒載體中可以插入組織細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，提高轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)錄靶向性，使慢病毒載體中的目的基因在特定的組織細(xì)胞中表達(dá)。主要的局限[6-7]：(1)在體水平表達(dá)較差、轉(zhuǎn)染動(dòng)物滴度低、效率低，滴度一般為108TU/mL；(2)中度免疫原性、細(xì)胞毒性大、有致瘤致突變的危險(xiǎn)，生物安全性較低；(3)表達(dá)周期長，約需96 h表達(dá)，作用起效緩慢。慢病毒載體的發(fā)展經(jīng)歷了4個(gè)階段，從第一代的兩質(zhì)粒系統(tǒng)到第四代的四質(zhì)粒系統(tǒng)[8]，載體系統(tǒng)不斷完善，生物安全性不斷提高，使其實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和動(dòng)物中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)和基因敲除都成為可能，并且繼續(xù)保留了自身失活的優(yōu)勢，在基因工程的研究中發(fā)揮著非常重要的作用。

1.2 腺病毒

腺病毒是直徑為65～80 nm的線性無包膜的雙鏈 DNA 病毒。其中纖維突起長度不同，血清型也各不相同。因此纖維突起具有血清特異性，且含有負(fù)責(zé)體外血細(xì)胞凝集的種屬特異性抗原決定位點(diǎn)[9]。腺病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中，經(jīng)過一系列剪切和轉(zhuǎn)錄過程，最終包裝成新的病毒顆粒[10]。腺病毒載體經(jīng)過第一代的復(fù)制區(qū)域缺失到第三代病毒基因的完全清除，不斷利用更強(qiáng)的啟動(dòng)子及調(diào)控序列來提高腺病毒攜帶的外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平[11]。目前，用于基因治療是以5型腺病毒為代表的腺病毒載體，主要具有以下優(yōu)勢[12-14]：(1)腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，體外實(shí)驗(yàn)通常接近100%的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；(2)可高效轉(zhuǎn)染不同類型的人組織細(xì)胞，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞所限；(3)外源基因容量大(7～8 kb)，滴度隨插入片段長度增加而降低；(4)通過細(xì)胞內(nèi)復(fù)制可達(dá)到較髙的滴度，在細(xì)胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達(dá)1011TU/mL；(5)安全性高，無插入突變激活癌基因的危險(xiǎn)；(6)腺病毒載體生產(chǎn)工藝簡便、制備純化相對容易。由于這些突出的優(yōu)勢，腺病毒載體在基因治療和臨床試驗(yàn)方面有了越來越多的應(yīng)用，成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之后廣泛應(yīng)用的病毒載體；但在應(yīng)用過程中仍存在細(xì)胞難穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、表達(dá)持續(xù)時(shí)間僅2～3周，動(dòng)物上表達(dá)效率低、免疫原性高、易引起炎癥反應(yīng)和系統(tǒng)毒性等局限[15]。近幾年，復(fù)制型、低抗原性和靶向腺病毒載體的出現(xiàn)，預(yù)示著隨著對腺病毒的深入研究，對于腺病毒的應(yīng)用會(huì)更加安全有效，在基因治療中發(fā)揮更加重要的作用。

1.3 AAV

AAV是基因組為4.7 kb的線狀單鏈無包膜DNA病毒，直徑為20～26 nm，屬于微小病毒科的依賴性病毒類，完整的感染周期需要腺病毒或者皰疹病毒參與，因此名為AAV。因此潛在的AAV基因組主要保持靜止?fàn)顟B(tài)，直到有利的輔助條件才進(jìn)行基因組切除和復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)病毒基因組表達(dá)。重組腺相關(guān)病毒載體(recombinant adeno-associated virus，rAAV) 源于非致病的野生型AAV，包括代替rep和cap基因的目的基因、啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化序列。rAAV載體傾向于定點(diǎn)整合至宿主基因組，即核糖體DNA序列和回文序列，有利于維持治療基因在分裂細(xì)胞的長期表達(dá)，并且減少了其他病毒隨機(jī)整合可能導(dǎo)致插入突變的風(fēng)險(xiǎn)[16]。AAV主要優(yōu)勢如下[17-18]：(1)安全性最高(RK1級別)，目前無報(bào)道其參與任何疾病的發(fā)生；(2)感染宿主范圍廣，感染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞；(3)相對特異性高，不同血清型可靶向不同器官；(4)免疫原性和宿主炎癥反應(yīng)極低；(5)表達(dá)時(shí)程長(可穩(wěn)定表達(dá)半年以上)；(6)超高的在體感染效率，滴度可達(dá)1012vg/mL；(7)具有較好的熱穩(wěn)定性和抗酸堿性；但也存在一定的局限[19-20]：(1)片段容量?。赫麄€(gè)AAV基因組4 kb，引入啟動(dòng)子、熒光基團(tuán)等固定元件后，外源插入片段在2 kb以內(nèi)；(2)瞬時(shí)表達(dá)量較低，感染后需要較長時(shí)間才能達(dá)到表達(dá)高峰；(3)低水平表達(dá)，細(xì)胞水平需要表達(dá)7 d左右，動(dòng)物水平需要表達(dá)2周左右；(4)感染體外細(xì)胞能力不強(qiáng)，細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染效率不高；(5)人類接觸多種AAV血清型，體內(nèi)中和抗體不斷上升。從以上看，AAV作為基因治療的基因遞送載體在基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床研究方面都具有非常廣闊的前景。

2 生物起搏中病毒載體的應(yīng)用選擇

目前生物起搏尚處于基礎(chǔ)研究階段，以病毒為載體進(jìn)行基因治療，從病毒載體的制備和選擇，到表達(dá)時(shí)間的不斷延長，均取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但隨之而來的致心律失常性、細(xì)胞毒性和致瘤性等安全問題也亟待解決。在基礎(chǔ)基因治療可細(xì)分為“體內(nèi)” 基因傳遞與“體外”基因傳遞兩種形式。

2.1 生物起搏的體外實(shí)驗(yàn)

體外實(shí)驗(yàn)是指在體外使用從其通常的生物學(xué)環(huán)境中分離的生物體組分進(jìn)行研究，包括細(xì)胞試驗(yàn)、體外器官試驗(yàn)等，離開了體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境調(diào)控，影響因素比較單一，且可人為控制，可實(shí)現(xiàn)物種特異性，可進(jìn)行更簡單、更方便和更詳細(xì)的分析。生物起搏中的體外實(shí)驗(yàn)主要是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將外源基因?qū)氚屑?xì)胞，研究基因的表達(dá)調(diào)控、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)常規(guī)上可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩大類。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，即外源基因進(jìn)入靶細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合在細(xì)胞的染色體上。典型代表就是腺病毒載體，因其體外轉(zhuǎn)染效率高、外源容量大、無插入突變危險(xiǎn)等上述優(yōu)點(diǎn)，因而是目前在國內(nèi)外生物起搏研究中應(yīng)用最多的病毒載體，常作為攜帶目的基因的載體介導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞，從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化。例如將攜帶Tbx18的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞，與新生大鼠心室心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，竇房結(jié)特異基因HCN4表達(dá)明顯高于對照組，并可檢測到超極化激活的內(nèi)向離子電流(If)[21]。近年來研究者致力于胚胎發(fā)育通路的再激活，誘導(dǎo)出生后的心肌細(xì)胞向起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即心肌重編程，一旦心肌細(xì)胞重編程，將不再需要誘導(dǎo)基因的持續(xù)表達(dá)[22]。竇房結(jié)的發(fā)育機(jī)制十分復(fù)雜，是Tbx3、Tbx5、Tbx18、Shox2、Isl1等多種基因的多重調(diào)控和相互作用的結(jié)果。因此聯(lián)合不同基因共表達(dá)，模擬竇房結(jié)發(fā)育過程，或許能從根本上實(shí)現(xiàn)形態(tài)和功能起搏。已有研究證明聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染能提高重編程效率，3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子即可誘導(dǎo)心肌重編程[23]。而腺病毒的外源片段容量較大，可以容納較多基因片段，為實(shí)現(xiàn)心肌重編程提供了前提條件。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染即目的基因整合至宿主細(xì)胞的染色體上，生物起搏中的典型代表為慢病毒。例如，Zhou等[24]將攜帶HCN2的慢病毒轉(zhuǎn)染至兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，與新生兔心室肌細(xì)胞共同培養(yǎng)后，HCN2轉(zhuǎn)染的骨髓干細(xì)胞的兔心肌細(xì)胞的平均搏動(dòng)頻率為(149±14)次/min，明顯高于對照組(87±11)次/min，并且可記錄到明顯的If電流。Feng等[25]將攜帶Shox2的慢病毒載體轉(zhuǎn)染犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并與新生大鼠心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)，與對照組相比心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率明顯增加，發(fā)現(xiàn)Tbx3、HCN4和Cx45表達(dá)上調(diào)，而Nkx2.3和Cx43表達(dá)下調(diào)，結(jié)果表明，Shox2的過表達(dá)可以調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在起搏器樣細(xì)胞中的分化。慢病毒載體可實(shí)現(xiàn)目的基因在細(xì)胞中的高水平表達(dá)，為生物起搏的前期篩選提供了有利的工具。

2.2 生物起搏的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是指在生物(微生物、動(dòng)物、人類)中進(jìn)行的研究，能夠真實(shí)反映受內(nèi)環(huán)境(主要是神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò))調(diào)控下干預(yù)措施的作用，是走向臨床必經(jīng)的階段。生物起搏的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，目前有效的體內(nèi)基因遞送方式包括心肌局部注射、心外膜下注射和心包腔注射。

前期研究者試圖通過腺病毒介導(dǎo)的離子通道基因的表達(dá)來誘導(dǎo)異位自律性。最常用的是心肌直接局部注射病毒載體，主要位點(diǎn)是左束支和希氏束，例如Boink等[26]將攜帶HCN2+AC1的腺病毒植入房室傳導(dǎo)阻滯狗的左束支，在7 d內(nèi)，犬的心率達(dá)到了(129±28.9)次/min，表明HCN2+AC1過表達(dá)比HCN2單基因表達(dá)具有更高效的生物起搏和更高的自主調(diào)節(jié)靈敏度。Cingolani等[27]將攜帶Kir2.1AAA+HCN2基因的腺病毒載體混合物通過導(dǎo)管注入三度房室傳導(dǎo)阻滯豬的希氏束，轉(zhuǎn)染基因的豬在14 d內(nèi)心率(93.5±7)次/min明顯高于安裝電子起搏器豬的心率(59.4±4)次/min，注射部位有明顯的自發(fā)起搏活動(dòng)；但轉(zhuǎn)基因表達(dá)易直接局限在注射位點(diǎn)周圍，轉(zhuǎn)染效率不佳。而心包腔注射，可以實(shí)現(xiàn)100%跨壁基因轉(zhuǎn)染心房，可以考慮應(yīng)用于生物起搏[28]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了腺病毒作為載體攜帶基因構(gòu)建生物起搏點(diǎn)有顯著的局限性，即相對短暫的起搏活性和較高的免疫原性。因?yàn)橄俨《静⒉幌衿渌《疽粯诱系剿拗骷?xì)胞的基因中，而是作為DNA游離體外存在于細(xì)胞核中，所以其介導(dǎo)的基因不能穩(wěn)定表達(dá)，并且腺病毒一般于第2～3天開始表達(dá)，第6～7天穩(wěn)定表達(dá)，最長持續(xù)28 d，可見腺病毒誘導(dǎo)的基因表達(dá)呈現(xiàn)短暫、瞬時(shí)、高效的特點(diǎn)，隨著時(shí)間的流逝目的基因漸漸的丟失，這使得起搏功能并不能長期穩(wěn)定地維持。

慢病毒載體與宿主細(xì)胞染色體隨機(jī)整合并能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，因此能實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的長期基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，使構(gòu)建穩(wěn)定的生物起搏點(diǎn)成為了可能。例如，Lu等[29]將HCN4修飾的骨髓干細(xì)胞通過慢病毒載體注射三度房室傳導(dǎo)阻滯狗的希氏束，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體內(nèi)表達(dá)功能性HCN4通道至少可以維持6周，產(chǎn)生生物起搏器活動(dòng)，導(dǎo)致起始于注射部位的休息和運(yùn)動(dòng)心率明顯高于對照組犬。然而慢病毒載體投入臨床使用，由于存在啟動(dòng)子插入激活癌基因或?qū)е乱职┗虻氖Щ睿渍T發(fā)腫瘤的可能性，因此其生物安全性仍存在很大的問題。但心臟組織主要由非分裂細(xì)胞組成，基因治療不需要轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞分裂，治療基因不參與細(xì)胞增殖，插入突變基因也從未證實(shí)在HIV陽性患者出現(xiàn)，所以，這種情況下，腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)較低，慢病毒因此普遍認(rèn)為是一個(gè)安全載體[30]。研究者應(yīng)不斷改進(jìn)慢病毒載體系統(tǒng)，提高其生物安全性，進(jìn)一步提高其病毒滴度，構(gòu)建一個(gè)長期穩(wěn)定的生物起搏點(diǎn)。

AAV是迄今為止最安全、 最良好、 最有前景的基因治療工具。迄今為止，已有超過150種突變體，13種人類和非人類血清型，可以特異性靶向不同的組織或器官[31]。在眾多血清型中，只有AAV-DJ比較適宜感染細(xì)胞，其余血清型表達(dá)效率較弱，但動(dòng)物在體感染表達(dá)效率高，因此多用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。對心肌組織親和力較強(qiáng)的有AAV1、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9五種血清型[32]。其中，AAV9在心臟可實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移且足夠安全不影響心臟其他正常功能，表明AAV9可能是實(shí)現(xiàn)心臟基因轉(zhuǎn)移載體的理想選擇[33]。Chan等[34]提議用rAAV9實(shí)現(xiàn)hHCN1ΔΔΔ(S3-S4連接被刪除，表達(dá)If電流生物學(xué)活性)在病態(tài)竇房結(jié)綜合征和完全性心臟傳導(dǎo)阻滯的豬模型中過表達(dá)，使心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦]房結(jié)樣細(xì)胞，增加起搏頻率。由于其片段容量小、體外感染效率低等局限，迄今為止，在生物起搏中的應(yīng)用仍較少。但AAV作為基因載體有著非常明顯的優(yōu)勢，隨著對其結(jié)構(gòu)和生物特性的研究深入，AAV載體系統(tǒng)的不斷完善，將在生物起搏的研究中發(fā)揮非常重要的作用。

綜上所述，理想的病毒載體應(yīng)是高滴度，具有優(yōu)先的預(yù)先形成的免疫力，并能逃避宿主免疫反應(yīng)，以預(yù)防與劑量相關(guān)的不良反應(yīng)。除上述載體系統(tǒng)外，在基因的遞送過程中，還有逆轉(zhuǎn)錄病毒、泡沫病毒等病毒載體和非病毒載體。另外，隨著干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用基因生物起搏和細(xì)胞生物起搏技術(shù)，最終得到了高水平的類似If的電流，產(chǎn)生自發(fā)搏動(dòng)心律[35-36]。研究者可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件選擇不同的載體，然而到現(xiàn)在為止，只有一個(gè)基因載體應(yīng)用于臨床，表明在基因治療中系統(tǒng)的靶向定位比預(yù)想中更復(fù)雜。日后關(guān)于生物起搏中病毒載體的研究，主要解決其免疫原性、細(xì)胞毒性和穩(wěn)定性等問題，隨著研究的深入和技術(shù)與方法的不斷完善，生物起搏有著非常廣闊的應(yīng)用前景，將成為人們治療緩慢性心律失常的新技術(shù)，造福于人類。

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