響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果醋的發(fā)酵條件

李小紅，陽如詩，魏韶，張小松，吳德智

(貴州理工學(xué)院，貴陽 550003)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)是薔薇科多年生落葉叢生灌木繅絲花的果實，果實多為扁球形漿果，成熟時為黃棕色[1]，是集保健、藥用及食用為一體的綠色水果[2]，具有獨特的芳香味，營養(yǎng)豐富，含有很多生物活性物質(zhì)，包括具有抗氧化作用的黃酮、類黃酮、VC、VP(蘆丁)等，有“三王水果”之稱[3]。但是刺梨果汁含有大量的單寧等多酚物質(zhì)[4]，具有較強的苦澀味[5]，因此直接食用會影響口感。

以水果或果品加工下腳料為主要原料，以酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵釀制而得到的營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特的調(diào)吳德智(1983-)，男，副教授，博士，研究方向：食品藥品研究與開發(fā)。

味品定義為果醋。果醋既有水果和食醋的營養(yǎng)保健功效，又是具有營養(yǎng)、保健及食療等功能為一體的新型調(diào)味品[6,7]。刺梨釀制成果醋，不僅可以解決刺梨口感問題，同時還保留了刺梨原有的營養(yǎng)物質(zhì)，并且發(fā)酵之后的產(chǎn)品吸收更好，增加刺梨的附加值[8-10]。

單因素試驗分別對刺梨果醋醋酸發(fā)酵過程的接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及裝液量4個因素的最佳工藝參數(shù)進行探討，然后通過響應(yīng)曲面法對以上4個因素進行優(yōu)化，獲得刺梨果醋發(fā)酵的最佳工藝條件，為刺梨果醋工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，為刺梨深加工產(chǎn)品的不斷開發(fā)利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑

果酒酵母1969、醋酸桿菌20056：中國發(fā)酵工業(yè)研究所(CICC)；刺梨：本地人工種植，充分成熟，新鮮無霉?fàn)€變質(zhì)；酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂：天津市華東試劑廠；其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 上海上天精密儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計 梅特勒-托利多國際股份有限公司； FA1004B型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；九陽 JYZ-E6型榨汁機 九陽股份有限公司；J0050024型生化培養(yǎng)箱 上海?，斣囼炘O(shè)備有限公司；WF32型精密色差儀 深圳威孚光電科技有限公司；PX-A1T型酒精濃度計 廣州市普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 刺梨果醋制作工藝流程[11]

1.3.2 操作過程

1.3.2.1 原料清洗

通過流動水漂洗挑選出成熟、飽滿、無蟲害及無霉?fàn)€變質(zhì)的刺梨。

1.3.2.2 破碎、酶解

將清洗處理好的刺梨果實打漿，為了提高出汁率，酶解時添加果膠酶55 mg/L，在50 ℃保溫酶解3.0 h。

1.3.2.3 調(diào)整成分

為了充分滿足酵母發(fā)酵的需求，加白砂糖將糖度調(diào)整為17%。

1.3.2.4 滅酶及滅菌

高溫可以使酶失效，因此在成分調(diào)整后通過升高溫度達到滅酶及滅菌的目的，在90 ℃保溫20 min。

1.3.2.5 酒精發(fā)酵

在刺梨果汁中按照果汁量3%接種加入果酒酵母1969，在30 ℃，發(fā)酵5天左右。

1.3.3 刺梨醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

本試驗針對原料裝液量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及醋酸菌接種量4個因素，保持其中3個因素固定不變，進行單因素試驗，以多酚和黃酮為次要指標(biāo)，醋酸產(chǎn)量為主要指標(biāo)，確定混料設(shè)計所需的水平。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

以醋酸產(chǎn)量為主要指標(biāo)，經(jīng)過對刺梨果醋配方的單因素試驗，選擇混料優(yōu)選范圍：醋酸菌接種量(A)(10%，12%，14%)、發(fā)酵時間(B)(9，10，11 天)、發(fā)酵溫度(C)(30，32，34 ℃)、裝液量(D)(8%，12%，16%)。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行混料設(shè)計，并以醋酸含量為指標(biāo)，從而選出最佳配方，試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗因子與水平表Table 1 The factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.4 指標(biāo)測定及方法

1.3.4.1 基礎(chǔ)指標(biāo)測定

醋酸產(chǎn)量測定，參考王穎等的方法[12]；色度值采用精密色差儀；酒精度采用酒度計。

1.3.4.2 總多酚的測定

采用福林酚法進行測定[13]。刺梨果醋適當(dāng)稀釋，吸取1 mL，加入0.2 mL福林酚試劑，搖勻，放置3 min 后加入1 mL 10% Na2CO3溶液，充分混合后室溫下靜置1 h，于760 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出總酚含量Y與吸光度X的標(biāo)準(zhǔn)方程： Y=0.4417X+0.0012，R2=0.9931，在1.0～15.0 mg/L濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.3.4.3 總黃酮的測定

本試驗采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量。參考白立敏等的方法[14]，精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，40%乙醇配制得130.0 mg/L的蘆丁儲備液。準(zhǔn)確移取儲備液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入40%乙醇4.0 mL，靜置5 min后加入5% NaNO3溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.5 mL 的10% Al (NO3)3溶液，搖勻，靜置5 min，最后加入3 mL 4% NaOH溶液，以乙醇為溶劑定容至10 mL。充分搖勻，靜置15 min后，于510 nm下測定吸光度，同時以空白試劑作參比。以吸光度Y為縱坐標(biāo)與濃度X為橫坐標(biāo)(mg/L)，得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程Y=0.1124X-0.0012，R2=0.9993。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 醋酸菌接種量對刺梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

取刺梨酒精發(fā)酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入6%，8%，10%，12%，14%的醋酸菌接種量，在30 ℃的環(huán)境中靜置發(fā)酵8天，然后測定果醋中的醋酸含量，結(jié)果見表2。

表2 醋酸菌接種量對果醋的影響Table 2 The single factor experimental results of acetic acid bacteria inoculation amount

隨著接種量的升高，果醋中的醋酸含量先逐漸升高后趨于平衡。多酚、黃酮含量逐漸降低，且多酚減少幅度最大。當(dāng)醋酸菌接種量為12%時，醋酸含量最高，為4.76 g/dL。在營養(yǎng)物質(zhì)一定的條件下，接種量過大時，發(fā)酵液內(nèi)醋酸菌的含量增大，導(dǎo)致消耗的營養(yǎng)也隨之增多，但是同時用于生成醋酸的底物又不變，從而導(dǎo)致醋酸產(chǎn)量相對降低[15]。

2.1.2 發(fā)酵時間對刺梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

取刺梨酒精發(fā)酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，裝液量為12%，在30 ℃下分別靜置發(fā)酵 7，8，9，10，11 天，測定果醋中的醋酸，結(jié)果見表 3 。

表3 發(fā)酵時間對果醋的影響Table 3 The single factor experimental results of fermentation time

隨著發(fā)酵時間的延長，果醋中的醋酸含量逐漸升高而后趨于平衡，在發(fā)酵第 11天時醋酸含量略有降低。當(dāng)發(fā)酵時間為10天時，醋酸含量最高。此外，隨著發(fā)酵時間的延長，多酚、黃酮含量逐漸降低，且多酚減少幅度最大。在營養(yǎng)物質(zhì)一定的條件下，發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液內(nèi)醋酸菌含量不斷增多，其消耗的營養(yǎng)也越多，同時用于生成醋酸的底物較少，從而使得產(chǎn)酸量也相對較低。

2.1.3 發(fā)酵溫度對刺梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

取刺梨酒精發(fā)酵后的樣品100 mL置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，裝液量為12%，分別在 26，28，30，32，34 ℃下靜置發(fā)酵10 天，測定果醋中的醋酸，結(jié)果見表 4。

表4 發(fā)酵溫度對果醋的影響Table 4 The single factor experimental results of fermentation temperature

隨著發(fā)酵溫度的升高，果醋中的多酚及黃酮含量均下降，這是因為溫度升高營養(yǎng)物質(zhì)分解速度加快導(dǎo)致。醋酸含量先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為 32 ℃時，醋酸含量最高，為4.86 g/dL。這是因為當(dāng)發(fā)酵溫度過低時，醋酸菌的生長代謝比較緩慢，醋酸產(chǎn)量低，隨著溫度的升高生長代謝加快，醋酸含量隨之增加，但是當(dāng)溫度過高時又會導(dǎo)致菌體老化，代謝性能降低。

2.1.4 裝液量對刺梨果醋醋酸發(fā)酵的影響

取刺梨酒精發(fā)酵后的樣品在裝液量為8%，12%，16%，20%，24%分別置于250 mL圓底燒瓶中，接種醋酸菌量為12%，32 ℃下靜置發(fā)酵10天，測定果醋中的醋酸，結(jié)果見表5 。

表5 裝液量對果醋的影響Table 5 The single factor experimental results of the volume of liquid

隨著裝液量的升高，果醋中的醋酸含量先升高后逐漸降低且降低效果明顯，這是因為醋酸菌是好氧菌，裝液量越多與空氣的接觸面積就越小，醋酸菌生成代謝得不到足夠的氧氣使醋酸發(fā)酵緩慢，醋酸產(chǎn)量反而減少。當(dāng)裝液量為12%時，醋酸含量最高，為4.98 g/dL。此外，隨著發(fā)酵液裝液量的升高，多酚、黃酮含量逐漸升高。這是因為裝液量較少時，溶解氧過高會導(dǎo)致還原性物質(zhì)多酚、黃酮的降解。

2.2 刺梨果醋發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取接種量(10%，12%，14%)、發(fā)酵時間(9，10，11天)、發(fā)酵溫度(30，32，34 ℃)及裝液量(8%，12%，16%)4個對刺梨果醋發(fā)酵有較大影響的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Benhnken試驗，以刺梨果醋的量為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，試驗設(shè)計見表6。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 The design and results of response surface analysis

續(xù) 表

2.3 Box-Benhnken響應(yīng)曲面設(shè)計優(yōu)化復(fù)合發(fā)酵果漿的發(fā)酵條件

采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Benhnken試驗，對各因素進行擬合，得到多元回歸方程：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

對刺梨果醋醋酸含量的回歸模型進行方差及顯著性分析，結(jié)果見表7。

表7 感官評分回歸方程的方差與顯著性分析Table 7 Variance and significant analysis of regression equation of sensory scores

續(xù) 表

該模型方程有顯著性影響(P<0.0001)，失擬項不顯著(P=0.0612>0.05)，說明在本試驗條件下，該回歸模型所考察的因素足以反映試驗中發(fā)酵條件對刺梨果醋含量的影響。判定系數(shù)R2=0.9832，Radj2=0.9671，說明回歸模型與實驗值擬合較好，可用于刺梨果醋含量的理論推測和分析，各因素影響大小依次為：發(fā)酵時間>裝液量>發(fā)酵溫度>接種量。由F檢驗可知，一次項中發(fā)酵時間、裝液量對刺梨果醋的產(chǎn)量具有極顯著影響(P<0.01)；在二次項中接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及裝液量對刺梨果醋的產(chǎn)量具有極顯著影響(P<0.01)；其他因素之間不顯著(P>0.05)。與圖1中3D效應(yīng)面圖反映出的各因素間的交互作用相吻合。

圖1 各因素交互的3D響應(yīng)面圖譜Fig.1 3D response surface of different interaction factors

由Design-Expert 8.0.6軟件得出刺梨果醋醋酸的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是接種量為11.65%，發(fā)酵時間為10.13天，發(fā)酵溫度為32.08 ℃，裝液量為11.58%，刺梨果醋醋酸含量為4.96 g/dL，為了便于生產(chǎn)，我們將接種量定為11.7 %、發(fā)酵時間定為10天、發(fā)酵溫度定為 32 ℃、裝液量定為11.6%。進一步驗證試驗，得出刺梨果醋醋酸含量為4.98 g/dL。該值與預(yù)測值比較近，因此選取此為刺梨果醋醋酸的發(fā)酵工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

通過單因素和 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗，利用統(tǒng)計學(xué)的方法建立了刺梨果醋發(fā)酵條件的二次多項式模型：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

由Design-Expert 8.0.6軟件得出刺梨果醋醋酸的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)是接種量為11.65%，發(fā)酵時間為10.13天，發(fā)酵溫度為32.08 ℃，裝液量為11.58%，刺梨果醋醋酸含量為4.96 g/dL，為了便于生產(chǎn)，我們將接種量定為11.7%、發(fā)酵時間定為10天、發(fā)酵溫度定為32℃、裝液量定為11.6%。與進一步驗證試驗數(shù)據(jù)基本吻合，也就是本試驗范圍內(nèi)建立的模型準(zhǔn)確有效，可用來預(yù)測刺梨果醋發(fā)酵工藝參數(shù)。得到的果醋醋香濃郁，味酸醇厚，營養(yǎng)成分豐富，具有很好的開發(fā)前景。

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