大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化分析

周國威 張夢琳

【摘要】 目的 分析大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化。方法 對給藥大鼠進行大青龍湯抗病毒有效部位正丁醇萃取物灌胃， 并應用高效液相色譜法（HPLC）對其中的含藥血清指紋圖譜進行分析、測定， 同時還需要深入分析和研究空白血清與大青龍湯正丁醇萃取物入血成分之間存在的差異。結(jié)果 通過分析、對比大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清和空白血清色譜圖可以看出， 除去空白血清中所含指紋峰， 在給藥30 min后出現(xiàn)較多的含藥血清指紋峰， 且峰值都相對較高， 共有45個峰， 其中原型成分25個，

2個指紋峰被分別指認為甘草苷與甘草酸單銨鹽。結(jié)論 通過分析比較大青龍湯抗病毒有效部位正丁醇萃取物入血成分以及相應的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)， 其入血成分的指紋峰比較多， 且兩者還存在著大量的對應指紋峰， 這表示其有效成分發(fā)揮作用主要是原型或代謝物進入到體內(nèi)發(fā)揮出相應的藥效， 可據(jù)此深入分析該處方的抗病毒藥效。

【關鍵詞】 大青龍湯;抗病毒有效物質(zhì)部位;血清藥化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.118

大青龍湯是《傷寒論》中的經(jīng)典方劑， 其中包括石膏、生姜、大棗、炙甘草、苦杏仁、桂枝、麻黃幾味藥材， 具有獨特的內(nèi)清里熱、外散表寒功效， 在郁熱內(nèi)聚、寒邪外束的傷寒兼里熱煩躁癥當中都得到有效應用， 目前在臨床中多被應用于急性腎炎、哮喘、慢性支氣管炎合并肺部感染、無汗癥、高熱癥、感冒等急癥治療中， 并獲得良好的應用效果[1]。本研究分析大青龍湯抗病毒有效物質(zhì)部位血清藥化。

1 材料與方法

1. 1 材料 儀器：1100型HPLC儀、XW-80A型渦旋混合器、KQ3200DE型超聲波清洗儀、AL204型1/10000分析天平、BP-211D型1/100000分析天平、BF2000-15A型15孔改進型氮吹儀、TGL-16G型離心機[2]。試藥：實驗室自制的正丁醇部位萃取物， 以及某食品藥品檢定研究院提供的甘草酸單銨鹽、甘草苷， 色譜純?yōu)榧状己鸵译妫?分析純?yōu)榱姿幔?超純氮氣。試驗動物：SPF級SD大鼠， 均為雄性， 體質(zhì)量230～270 g[3]。

1. 2 方法

1. 2. 1 液相色譜條件 色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18柱， 5 μm， 規(guī)格與流動相分別為250 mm×4.6 mm和0.05%磷酸水（A）-乙腈（B）， 分析時間為85 min， 流速和柱溫分別控制在0.8 ml/min、25℃， 進樣量為15μl， 檢測波長為250 nm。

1. 2. 2 制備供試品溶液

1. 2. 2. 1 制備大青龍湯正丁醇萃取物供試液 精確稱量出0.1008 g上面得到的正丁醇萃取物樣品， 放入量瓶中， 然后將適量甲醇溶液加入到量瓶當中， 超聲溶解量瓶當中的混合物， 并完成定容、搖勻步驟操作。對量瓶當中的2 ml甲醇溶液定容， 達到標準刻度后用0.45 μm微孔濾膜過濾， 進而完成供試品溶液制備工作。

1. 2. 2. 2 制備大青龍湯正丁醇萃取物灌胃液 在大青龍湯正丁醇部位提取適量的萃取物， 溶解到注射用水當中， 將其配置成0.6 g/ml的混懸液， 為后續(xù)實驗操作做好準備。

1. 2. 2. 3 制備大青龍湯正丁醇萃取物 將一定量的乙醇溶液70%加入到大青龍湯藥材處方當中， 并分別進行兩次提取， 然后再合并兩次提取到的提取液， 濃縮， 然后分別萃取正丁醇、醋酸乙酯、氯仿、石油醚， 合并得到的正丁醇萃取液， 濃縮， 減壓干燥后就能夠得到大青龍湯正丁醇萃取物[4， 5]。

1. 2. 3 制備對照品供試液 稱取出1.03 mg甘草苷對照品， 1.05 mg甘草酸單銨鹽對照品， 加入甲醇后超聲溶解， 制備出對照品供試液。

1. 2. 4 制備和處理含藥血清

1. 2. 4. 1 給藥與采血 將15只SD大鼠按照隨機分配原則分為五組， 其中4組是給藥組， 1組是空白組。給藥組大鼠需要按照1.5 ml/100 g的劑量給藥， 3次/d， 在給藥前12 h需要禁食， 末次給藥的時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 h， 從大鼠眼眶中分別取出1 ml血液?？瞻捉M大鼠用注射用水進行灌胃， 其具體的操作方法與上述相同， 在最后一次灌胃后一次性取血。最后將所有得到的血液進行離心處理， 3000 r/min， 離心10 min， 將血清分離后放入到-20℃的冰箱中冷藏備用。

1. 2. 4. 2 血清樣品處理 將每一小組相同時間提取的大鼠含藥血清合并， 混合均勻， 從中量取出1 ml血清， 將3 ml乙腈加入其中， 渦旋混合10 min， 離心處理10 min， 15000 r/min， 取出上述得出的清液適量， 并用40℃氮氣吹干。在剩下的殘渣當中加入100 μl甲醇， 簡單混合后還需要進行10 min渦旋混合， 離心10 min， 15000 r/min， 用0.45 μm微孔過濾膜過濾， 得出的過濾液就是含藥血清供試品溶液[6]。用相同的方法處理空白組大鼠血清。

1. 2. 4. 3 分析大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清成分分析

在相同色譜條件下對相等量的空白血清、含藥血清、對照品、大青龍湯正丁醇萃取物進行HPLC分析， 并根據(jù)結(jié)果建立HPLC特征指紋圖譜， 對其中的移行成分差異進行分析， 將對照品色譜峰作為標準分析各特征指紋圖譜中色譜峰成分。

2 結(jié)果

采用HPLC色譜圖分析大青龍湯正丁醇萃取物， 最終得出了40個色譜峰。見圖1。通過分析、對比大青龍湯正丁醇萃取物含藥血清和空白血清色譜圖可以看出， 除去空白血清中所含指紋峰， 在給藥30 min后出現(xiàn)較多的含藥血清指紋峰， 且峰值都相對較高， 共有45個峰， 其中有25個幾乎與正丁醇物質(zhì)部位色譜峰tR保持一致， 這可能是藥物入血原型成分， 其中17號色譜峰對應甘草苷對照品色譜峰， 41號色譜峰對應甘草酸單銨鹽對照品色譜峰， 這樣就表示都屬于甘草苷和甘草酸單銨鹽。剩下的20個色譜峰則可能會應激產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。