乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的抑菌作用及其機(jī)制分析

王鳳婷，孫芝蘭，吳海虹，許曉曦*，劉 芳,*，王道營(yíng)，耿志明，諸永志，徐為民

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

食品及其原料營(yíng)養(yǎng)豐富，在收獲、加工、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中極易腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生有害物質(zhì)或滋生新的致病菌微生物，微生物污染是影響食品安全的重要原因之一[1]。陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，是一種革蘭氏陰性粗短桿菌，可在人和動(dòng)物的糞便、腸道以及植物中檢出[2]。陰溝腸桿菌也可引起食源性疾病，有研究表明在嬰幼兒奶粉[3]、冷凍冷飲食品[4]及即食食品[5]中均有其檢出，在食品制作工程中，由于原料、儀器、容器消毒不徹底就會(huì)造成其污染，產(chǎn)生腐胺及尸胺導(dǎo)致食品腐敗[6]。陰溝腸桿菌已成為醫(yī)院感染越來(lái)越重要的病原菌，引起的細(xì)菌感染性疾病，常累及多個(gè)器官系統(tǒng)，包括皮膚軟組織感染[7]、泌尿道感染呼吸道感染以及敗血癥等，但由于其產(chǎn)生的酶具有很強(qiáng)的耐藥性[8]，因此臨床治療有難度。國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于抑制陰溝腸桿菌的報(bào)道，Pereira等[9]研究體外模擬體內(nèi)緩沖液條件下對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用；梁潔等[10]通過(guò)天然活性物質(zhì)抑制其生長(zhǎng)。通過(guò)消除食品中的陰溝腸桿菌，能夠從根源上解決很大一部分安全問(wèn)題。

乳酸作為一種天然食品防腐劑[11]，能夠在抑制有害菌生長(zhǎng)的同時(shí)保證食品的安全性。乳酸為三大有機(jī)酸之一[12]，可以參與人體正常代謝，對(duì)人體無(wú)害[13]，因此作為食品添加劑應(yīng)用于食品加工中，可用作酸度調(diào)節(jié)劑、酸化劑、抗微生物劑、腌漬劑、增味劑、香料[14]。乳酸并非食物自身存在[15]，主要是由食品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生，如酸奶、腌菜、奶酪等[16]，乳酸對(duì)許多微生物都有抑制作用[17]。從國(guó)內(nèi)外[18-19]關(guān)于乳酸菌抑菌效果的報(bào)道來(lái)看，主要研究的是菌株本身的或其除有機(jī)酸類產(chǎn)物的抑菌效果及機(jī)理，如乳酸菌素（Nisin）[20]對(duì)致病菌或腐敗菌的抑制殺菌效果，關(guān)于其產(chǎn)物乳酸的抑菌效果研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)以從冰鮮雞肉中分離的陰溝腸桿菌為目標(biāo)菌株，研究乳酸對(duì)其殺菌作用的機(jī)理，為研發(fā)以乳酸為基礎(chǔ)的復(fù)合保鮮劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰溝腸桿菌C4為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所從冰鮮雞肉中分離獲得；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 海博生物公司。

5(6)-cFDA乳酸、DiSC3(5) 美國(guó)Sigma公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 生工生物工程（上海）股份有限公司；ATP檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine，NPN） 上海麥克林生化科技有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（2-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG） 南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Accuri C6流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；PE（Ultra View VOX）轉(zhuǎn)盤式激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM） 美國(guó)鉑金埃爾默公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株及培養(yǎng)

將陰溝腸桿菌C4接種于新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)再次轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基，重復(fù)3 次后，將菌液與滅菌后體積分?jǐn)?shù)30%的甘油以1∶1的體積比混合后保存在-40 ℃冰箱中?；罨瘯r(shí)將凍存的菌液解凍后以體積分?jǐn)?shù)1%接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，備用。

1.3.2 細(xì)菌活性實(shí)驗(yàn)

TSB及瓊脂按照一定比例配制培養(yǎng)基，滅菌后倒入無(wú)菌平板中，凝固后待用。將活化后的陰溝腸桿菌C4菌液按1%接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，待37 ℃搖床培養(yǎng)到OD600nm值為1.0時(shí)，取20 mL菌液，離心收集菌泥，加入相同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25%、0.5%、1.0%的乳酸溶液，將菌懸液放入搖床中，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣，使用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）按照10 倍遞增稀釋法稀釋樣品至相應(yīng)濃度[21]，取100 μL均勻涂布于TSB平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后，記錄菌數(shù)。

1.3.3 透射電鏡觀察

將活化好的陰溝腸桿菌C4菌液以1%的體積分?jǐn)?shù)接種于TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中培養(yǎng)直至對(duì)數(shù)期，5 000 r/min、4 ℃離心10 min后，用PBS（pH 7.4）洗滌，去掉上清液，加入同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的乳酸溶液，以只加入相同體積PBS作為對(duì)照。在37 ℃處理2 h，以5 000 r/min離心10 min，再用PBS洗滌3 次，除凈上清液，4 ℃條件下用2.5%的戊二醛固定12 h[22]。已固定好的菌體，采用2%瓊脂預(yù)包埋，切成1 mm3小塊，緩沖液洗滌2 次，再用2%鋨酸溶液固定1 h，緩沖液洗滌3 次，以60%、70%、80%和90%丙酮溶液，順序脫水各1 次，每次10 min，然后以無(wú)水丙酮重復(fù)脫水2 次，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋，梯度烘干，采用萊卡超薄切片機(jī)切成厚度為30 nm的樣品，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡（操作電壓80 kV）觀察、拍照[23]。

1.3.4 細(xì)胞膜滲透性分析

1.3.4.1 CLSM檢測(cè)

細(xì)胞膜滲透性的實(shí)驗(yàn)使用熒光探針cFDA[24]和PI來(lái)區(qū)分活細(xì)胞及死細(xì)胞。將對(duì)數(shù)期的菌液以5 000 r/min離心10 min，去上清液，用生理鹽水（0.85% NaCl）洗滌1 次，加入同體積1.0%的乳酸，加入同體積生理鹽水的作為空白對(duì)照組，室溫培養(yǎng)2 h，每15 min振蕩1 次。離心后懸浮在500 μL的生理鹽水中，每個(gè)樣品加入熒光探針cFDA使其終濃度達(dá)到100 μmol/L，避光保存10 min；然后在每個(gè)樣品中加入10 μL紅色核酸熒光染液PI，終濃度為30 μmol/L，避光反應(yīng)10 min?；旌弦弘x心后用500 μL生理鹽水懸浮菌泥，取3 μL菌液到載玻片上，加上蓋玻片，置于CLSM下觀察，拍照。

1.3.4.2 細(xì)胞外膜與細(xì)胞內(nèi)膜通透性實(shí)驗(yàn)

乳酸處理陰溝腸桿菌后細(xì)胞外膜的通透性使用熒光探針NPN檢測(cè)[25]，細(xì)菌細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)洗滌并重懸于0.85%生理鹽水，加入熒光探針NPN，使其終濃度達(dá)到10 μmol/L。加入乳酸（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%、0.5%、1.0%），加入同體積生理鹽水作為空白對(duì)照。使用酶標(biāo)儀以激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)429 nm檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。細(xì)胞內(nèi)膜通透性通過(guò)以O(shè)NPG作為反應(yīng)底物[26]，測(cè)定由陰溝腸桿菌C4中進(jìn)入培養(yǎng)液中的β-半乳糖苷酶的活性。過(guò)夜培養(yǎng)后的菌液1%接種至含2%乳糖的TSB培養(yǎng)基中，至對(duì)數(shù)期時(shí)以6 000 r/min離心10 min收集菌體，洗滌并懸浮于0.85%生理鹽水中。然后在菌懸液中加入乳酸，使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.25%、0.5%、1.0%，在搖床中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣，離心后取上清液，加入ONPG（終濃度為1.5 mmol/L），37 ℃培養(yǎng)30 min后，測(cè)定其產(chǎn)物o-硝基苯酚在420 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3.4.3 胞外ATP和紫外吸收物質(zhì)的測(cè)定

將活化后的菌液轉(zhuǎn)接，達(dá)到對(duì)數(shù)期后以5 000 r/min離心10 min，使用PBS（pH 7.4）洗滌3 次，將菌泥懸浮在乳酸溶液中，25 ℃培養(yǎng)，分別在0、10、30、60、120、180 min取樣。12 000 r/min、4 ℃離心1 min，取上清液測(cè)定其胞外ATP濃度和紫外吸收物質(zhì)的含量變化。ATP的測(cè)定利用試劑盒（碧云天）進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書的介紹，先做出濃度-熒光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，接下來(lái)在樣品中加入ATP檢測(cè)試劑，混合均勻后立即測(cè)其化學(xué)發(fā)光值[27]。紫外吸收物質(zhì)的含量以O(shè)D260nm值表示。

1.3.5 流式細(xì)胞測(cè)定

使用1.3.4節(jié)中處理好的菌液，依次用cFDA和PI染色[28]，12 000 r/min離心1 min收集菌體除去多余的熒光探針后，重懸于PBS中。流式細(xì)胞儀測(cè)定時(shí)，以低速率（400～600 個(gè)/s）收集50 000 個(gè)細(xì)胞，分別檢測(cè)細(xì)胞中的綠、紅熒光然后轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，在525 nm和620 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品綠色、紅色熒光。

1.3.6 細(xì)胞電勢(shì)能的測(cè)定

細(xì)菌細(xì)胞的膜電位使用熒光探針DiSC3(5)測(cè)定，過(guò)夜培養(yǎng)的菌1%接種于TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)直至對(duì)數(shù)期，6 000 r/min、4 ℃離心10 min，除上清液。使用5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸與5 mmol/L葡萄糖配制的緩沖液（緩沖液A）洗滌2 次[29]，陰溝腸桿菌C4重懸于緩沖液A與2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）組成的體系中，促進(jìn)熒光探針進(jìn)入菌體。在樣品中加入熒光探針DiSC3(5)使其終濃度達(dá)到0.5 μmol/L，在室溫下放置15 min。樣品中加入乳酸后，每個(gè)樣品取200 μL加入黑色的NBS板中，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為622 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為670 nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的殺菌效果

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的殺菌效果Fig. 1 The antibacterial effect of lactic acid on E. cloacae at different concentrations

從圖1可以看出，當(dāng)初始菌數(shù)約為107CFU/mL時(shí)，1.0%的乳酸在30 min時(shí)完全殺死細(xì)菌，0.5%及0.25%的乳酸完全殺死細(xì)菌分別需要60 min和120 min。在實(shí)驗(yàn)的起始點(diǎn)（0 min）時(shí)3 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸處理組菌數(shù)均有一定減少，說(shuō)明乳酸對(duì)于陰溝腸桿菌具有一定的瞬時(shí)殺菌作用。乳酸處理的樣品在實(shí)驗(yàn)的前30 min殺菌速度最快，并且較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳酸對(duì)于陰溝腸桿菌也能達(dá)到很好的殺菌效果。

2.2 菌體內(nèi)部觀察

圖2 乳酸處理陰溝腸桿菌后的透射電鏡結(jié)果Fig. 2 TEM images of LA-treated E. cloacae cells

透射電鏡能夠直觀地看出乳酸處理陰溝腸桿菌后其細(xì)胞壁及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。切片時(shí)細(xì)菌細(xì)胞一部分沿著橫截面，另一部分沿著縱面切片，圖中細(xì)胞由圓形與長(zhǎng)圓形組成。如圖2所示，未添加乳酸的對(duì)照組陰溝腸桿菌表面光滑無(wú)破裂及氣孔，細(xì)胞壁完整并與細(xì)胞膜界限明顯，細(xì)胞內(nèi)部成分無(wú)滲漏；經(jīng)過(guò)1.0%乳酸處理后的細(xì)菌細(xì)胞體積增大，細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，質(zhì)壁分離，雖然細(xì)菌仍然保持著細(xì)胞的基本形態(tài)，但是內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)分布不均勻并出現(xiàn)空腔，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)漏出后整體逐漸透明。這說(shuō)明乳酸能夠快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并破壞細(xì)胞質(zhì)膜[30]，并且增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部成分泄漏導(dǎo)致細(xì)胞失活。

2.3 乳酸作用增加膜通透性分析

2.3.1 CLSM結(jié)果

通過(guò)兩種核酸熒光探針cFDA和PI染色后，細(xì)胞質(zhì)膜的通透性變化在圖3中直觀顯示。cFDA能夠進(jìn)入所有細(xì)胞，而PI僅能進(jìn)入受損細(xì)胞，熒光探針PI進(jìn)入后導(dǎo)致cFDA熒光減少[31]。染色后完整的細(xì)胞在圖中呈現(xiàn)為綠色熒光，破損的細(xì)胞則被PI染成紅色熒光。未經(jīng)乳酸處理的空白對(duì)照組樣品染色后主要為綠色熒光同時(shí)有少量黃色和紅色，經(jīng)過(guò)1.0%乳酸處理1 h后的樣品大部分為紅色熒光，以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)過(guò)乳酸處理后陰溝腸桿菌細(xì)胞膜通透性增加。

圖3 乳酸處理后陰溝腸桿菌在CLSM下的狀態(tài)Fig. 3 CLSM images of LA-treated E. cloacae cells

2.3.2 細(xì)胞外膜與細(xì)胞內(nèi)膜通透性分析

圖4 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌外膜通透性的影響Fig. 4 Time-dependent effect of LA on the outer membrane permeability of E. cloacae

細(xì)胞外膜作為革蘭氏陰性菌的一種獨(dú)特結(jié)構(gòu)，使用疏水性熒光探針NPN檢測(cè)其通透性。外膜受到損傷后NPN才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生熒光，因此本研究中每分鐘測(cè)定429 nm波長(zhǎng)處的熒光值來(lái)反映細(xì)胞外膜通透性的改變（圖4），0 min時(shí)未加入處理劑，加入1.0%乳酸處理1 min后熒光值達(dá)到最高，檢測(cè)到熒光值達(dá)到55 000以上，而空白樣品的熒光值基本沒(méi)有不變。陰溝腸桿菌作用明顯，對(duì)其外膜有破壞作用[32]，并且作用迅速。細(xì)菌內(nèi)膜滲透性的檢測(cè)以O(shè)NPG為底物，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膜被破壞后，胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶釋放到胞外環(huán)境中，分解ONPG生成半乳糖及o-硝基苯酚，后一種產(chǎn)物為黃色，可以通過(guò)測(cè)定其在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)空白樣品及處理樣品在各時(shí)間點(diǎn)420 nm波長(zhǎng)處吸光度均在0.05～0.06之間，無(wú)明顯變化，由于本實(shí)驗(yàn)中乳酸處理時(shí)的pH值在2.2左右，會(huì)影響到β-半乳糖苷酶的活性，因此該結(jié)果不能說(shuō)明乳酸處理后陰溝腸桿菌內(nèi)膜通透性是否變化。

2.3.3 胞外ATP的測(cè)定結(jié)果

圖5 乳酸處理陰溝腸桿菌后胞外ATP濃度（A）和紫外吸收物質(zhì)（B）的變化Fig. 5 Changes in extracellular ATP levels (A) and UV-absorbing materials (B) in E. cloacae cells treated with LA at different concentrations

本研究首先通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品確定了ATP濃度與熒光值的定量關(guān)系（y=264 312x+2 595.3，R2=0.999），然后根據(jù)待測(cè)樣品的熒光值確定樣品中ATP濃度，結(jié)果見(jiàn)圖5A。對(duì)照組樣品最初（0 min）胞外ATP濃度為19 nmol/mL，取樣持續(xù)時(shí)間為3 h，在取樣期間內(nèi)，ATP濃度變化不明顯。1.0%乳酸處理后，胞外ATP濃度明顯增加，30 min內(nèi)變化趨勢(shì)較快，隨后變化緩慢，測(cè)定時(shí)間內(nèi)從最初462 nmol/mL增加到745 nmol/mL。在Liu Guorong等[31]研究中同樣提到bifidocin A對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抑菌處理后胞外ATP濃度增加，說(shuō)明乳酸處理后引起胞內(nèi)ATP的大量漏出。紫外吸收物質(zhì)主要包括大分子的蛋白質(zhì)和核酸等。1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳酸處理后胞外溶液的OD260nm值在處理期間要比對(duì)照組高（圖5B），說(shuō)明處理組胞外紫外吸收物質(zhì)的含量要高于對(duì)照組，說(shuō)明乳酸處理會(huì)引起胞內(nèi)大分子等的流失。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

用乳酸處理陰溝腸桿菌后細(xì)胞膜的完整性通過(guò)熒光探針cFDA和PI雙重染色驗(yàn)證[18]，可以區(qū)分正?；罴?xì)胞、死細(xì)胞及受損傷的活細(xì)胞。完整的細(xì)胞膜阻止核酸染料PI進(jìn)入，損傷的細(xì)胞允許PI進(jìn)入；cFDA可以進(jìn)入所有細(xì)胞，但由于DNA對(duì)于PI的親和力高于cFDA，所以死細(xì)胞中PI代替cFDA[33]。根據(jù)乳酸處理前后細(xì)胞的狀態(tài)獲得點(diǎn)狀圖，不同象限代表不同狀態(tài)的細(xì)胞：第1象限（Q1-LR）：由cFDA染色的活細(xì)胞；第2象限（Q1-UR）：雙重染色的受損細(xì)胞；第3象限（Q1-UL）：PI染色的死亡細(xì)胞；第4象限（Q1-LL）：未染色細(xì)胞。未處理細(xì)胞與經(jīng)過(guò)1.0%乳酸處理1 h后的細(xì)胞分布有很明顯的差異，未處理樣品（圖6A）96.4%為完整活細(xì)胞，處理后（圖6B）為34.4%受損細(xì)胞和63.3%的死細(xì)胞，Q1-UR與Q1-LR部分百分?jǐn)?shù)增加證明細(xì)胞損傷及膜的破壞，因此流式細(xì)胞儀的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的細(xì)胞膜具有破壞作用。

圖6 乳酸處理后陰溝腸桿菌的流式點(diǎn)狀圖Fig. 6 Flow cytometry dot plots of LA-treated E. cloacae cells

2.5 細(xì)胞電勢(shì)能分析

乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的處理會(huì)引起細(xì)胞電勢(shì)的變化，需氧或兼性細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞膜獲取質(zhì)子梯度（質(zhì)子動(dòng)力）轉(zhuǎn)化為ATP并將營(yíng)養(yǎng)素傳遞進(jìn)入細(xì)胞[27]，質(zhì)子動(dòng)力的主要組成為電勢(shì)梯度。熒光探針DiSC3(5)是一種對(duì)膜電勢(shì)變化敏感的染料，能夠在完整的極化細(xì)胞膜中積累并自行淬滅。去極化后電勢(shì)的變化導(dǎo)致DiSC3(5)從細(xì)胞膜中釋放，熒光值增加。由于陰溝腸桿菌為革蘭氏陰性菌，熒光探針不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此處理樣品的緩沖液中加入EDTA，對(duì)熒光探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起到促進(jìn)作用。每4 min對(duì)670 nm波長(zhǎng)處的熒光值進(jìn)行測(cè)定（圖7），對(duì)照組樣品熒光值保持6 000左右?guī)缀醪蛔儯?.0%乳酸處理后的樣品在最初（0 min）為9 559，高于對(duì)照組，這是由于加入乳酸到開(kāi)始測(cè)定需要大約1 min，期間乳酸已經(jīng)開(kāi)始對(duì)陰溝腸桿菌作用，導(dǎo)致膜電勢(shì)增加。

通過(guò)以上研究顯示乳酸的殺菌速度較快，在2 h內(nèi)可以殺死大于6（lg（CFU/mL））的陰溝腸桿菌。Xu等[34]研究發(fā)現(xiàn)香芹酚與百里香酚作用6 h后大腸桿菌降低小于6（lg（CFU/mL））。乳酸處理后雖然細(xì)胞形狀不變，整體結(jié)構(gòu)完整，但是在細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞外膜通透性變化明顯，伴隨著ATP小分子和大分子的紫外吸收物質(zhì)的釋放，并且膜電勢(shì)有顯著變化，說(shuō)明乳酸處理后陰溝腸桿菌的細(xì)胞膜通透性發(fā)生了變化。研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶功能化金納米顆粒[35]在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞作用時(shí)，細(xì)胞變形，破壞了細(xì)胞壁細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性的改變是多數(shù)抗菌物質(zhì)引起細(xì)胞損傷的主要原因。

圖7 乳酸處理后陰溝腸桿菌細(xì)胞電勢(shì)能變化Fig. 7 Change in membrane potential of LA-treated E. cloacae cells

3 結(jié) 論

本研究中使用乳酸作用于陰溝腸桿菌，結(jié)果表明質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%、0.5%、1.0%的乳酸均有殺菌效果，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)殺菌速度最快。透射電鏡的結(jié)果可以看出處理前后細(xì)胞變形，細(xì)胞壁損傷明顯，細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物流出。CLSM和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)乳酸處理后細(xì)菌細(xì)胞大量死亡，染色后紅色熒光探針PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，說(shuō)明菌株細(xì)胞通透性增強(qiáng)。細(xì)胞外膜通透性、細(xì)胞電勢(shì)及胞外ATP濃度和紫外吸收物質(zhì)變化明顯，并且在較短的處理時(shí)間時(shí)上升較快，之后變化趨勢(shì)平緩，說(shuō)明乳酸對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的瞬時(shí)作用明顯，殺菌效果較快。因此，乳酸對(duì)陰溝腸桿菌的作用方式主要是通過(guò)改變細(xì)胞壁形態(tài)，使細(xì)胞膜通透性增加，改變細(xì)胞內(nèi)外電勢(shì)，胞內(nèi)ATP及其他內(nèi)容物滲出。

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