酪蛋白鐵螯合肽的分離純化及結(jié)構(gòu)解析

紀(jì)曉雯，王志耕*，闞文翰，梅 林，薛秀恒

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

酪蛋白經(jīng)酶解或消化后可得到螯合金屬元素生物活性功能的肽段[1]，具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅等礦物質(zhì)元素吸收的特性[2-3]。鐵是人體必需的微量元素之一，它在機(jī)體代謝中有著重要作用。膳食中若長(zhǎng)期缺鐵，會(huì)影響紅細(xì)胞的正常代謝，引起缺鐵性貧血，同時(shí)降低人體免疫力[4]。鐵螯合肽由于其獨(dú)特的螯合結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，比市場(chǎng)上流通的無(wú)機(jī)鐵、有機(jī)酸鐵更易于吸收[5-7]。已有不少學(xué)者采用離子交換[8-9]、凝膠過(guò)濾[10]、超濾[11]和高效液相色譜[12]對(duì)酪蛋白金屬螯合肽進(jìn)行分離純化。固相金屬親和層析（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）作為一種新型的分離技術(shù)，利用蛋白質(zhì)表面某些氨基酸的殘基與過(guò)渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等親和能力的不同而進(jìn)行分離[13]，已被一些學(xué)者嘗試應(yīng)用在乳鐵蛋白[14]、麥胚蛋白[15]、大豆蛋白[16]、乳清蛋白[17]、牛肉蛋白[18]等金屬螯合肽的分離當(dāng)中。在酪蛋白多肽純化方面，離子交換法已大量使用，而關(guān)于IMAC的研究并不多見，Bernos等[19]曾利用此方法發(fā)現(xiàn)色氨酸、酪氨酸和組氨酸對(duì)蛋白多肽與金屬具有螯合作用，Lin Fuyong等[20]則研究pH值、鹽濃度對(duì)酪蛋白磷酸肽洗脫的影響。因此有必要對(duì)比這2 種方法對(duì)酪蛋白鐵螯合肽的分離效果，并對(duì)螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。基于鐵螯合肽特殊的生理活性，可為營(yíng)養(yǎng)保健食品、食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

利用胰蛋白酶酶解酪蛋白得到多肽混合物，對(duì)比IMAC和陰離子交換層析結(jié)合Sephacryl S-100 HR凝膠層析法對(duì)酪蛋白鐵螯合肽的分離純化效果，從而獲得鐵螯合能力強(qiáng)的肽段，再通過(guò)質(zhì)譜、紫外、紅外光譜測(cè)定其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)，為酪蛋白多肽補(bǔ)鐵劑的制備、結(jié)構(gòu)解析和補(bǔ)鐵機(jī)理研究提供一定實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白（純度92%）、菲啰嗪一鈉 上海源葉生物有限公司；三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）（超純）、二硫蘇糖醇 北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙酸鈉、氯化鈉（均為色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；FeCl2·4H2O、無(wú)水乙醇、NaOH、HCl（均為分析純）、胰蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（粉劑）、絲氨酸 合肥博美生物科技有限公司；鄰苯二甲醛 美國(guó)Sigma公司；蒸餾水 廣州屈臣氏有限公司；總蛋白定量測(cè)定試劑盒（BCA法） 南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白、細(xì)胞色素C、桿菌肽 中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙氨酰乙氨酰乙氨酸 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA UPC10蛋白純化平臺(tái) 美國(guó)GE公司；UV-2102紫外-可見光分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；傅里葉紅外光譜儀、LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀（配有納噴電離源及SEQUEST數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo Fisher公司；Gamma1-16 LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；分析天平（千分之一） 上海奧豪斯儀器有限公司；超純水機(jī) 湖南科爾頓水務(wù)有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；脫鹽柱 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的酶解及水解度的測(cè)定

稱取50 g的酪蛋白，用超純水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的酪蛋白溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，胰蛋白酶水解參考陳美姣[21]實(shí)驗(yàn)條件：溫度58 ℃、pH 7.4、胰蛋白酶與酪蛋白質(zhì)量比7∶1 000、時(shí)間2 h，酶解過(guò)程中用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，并維持pH值恒定。酶解結(jié)束后將酶解液立即放置于100 ℃水浴鍋中滅酶5 min，冷卻至室溫，蛋白水解度采用OPA法[22]測(cè)定。用1 mol/L的鹽酸將冷卻后的酶解液pH值調(diào)至4.6，5 000 r/min離心15 min，取上清液，向上清液中加入10%氯化鈣至終體積的1%，再加95%乙醇溶液至終體積的50%，隨后6 000 r/min離心10 min，將沉淀冷凍干燥，得到酪蛋白多肽粗品。

1.3.2 鐵螯合活性的測(cè)定

參照Torres-Fuentes[23]、Guo Lidong[24]等的方法，菲啰嗪可與游離的亞鐵離子形成鐵-菲啰嗪絡(luò)合物。將1.3.1節(jié)冷凍干燥后的多肽粉末用pH 5.5、0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉配制成0.2 mg/mL的溶液，吸取2.5 mL于玻璃管中，加入300 μL濃度為1 mmol/L的FeCl2·4H2O，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.02 mol/L菲啰嗪200 μL，在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以乙酸-乙酸鈉的樣品為空白對(duì)照，平行3 次。鐵螯合活性為單位質(zhì)量多肽能螯合的亞鐵離子質(zhì)量，以μg/mg表示。

1.3.3 酪蛋白鐵螯合肽的分離

1.3.3.1 IMAC分離

洗脫條件參照Torres-Fuentes等[25]方法，固定金屬為Cu2+。稱取30 mg 1.3.1節(jié)冷凍干燥后的肽粉末溶解在1 mL緩沖液A（0.05 mol/L pH 7.4乙酸鈉溶液-0.5 mol/L氯化鈉溶液），上樣前經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾，色譜柱：Hitrap IMAC FF，柱體積：5 mL，上樣后用緩沖液A洗脫至基線平穩(wěn)，之后用緩沖液B（0.05 mol/L pH 4.0乙酸鈉溶液-0.5 mol/L氯化鈉溶液）線性梯度洗脫：0～40 min，100% A；40～90 min，0%～100% B；90～103 min，100% B。流速1 mL/min，3 min/管，收集洗脫峰，調(diào)節(jié)洗脫峰收集液pH值到5.5后用菲啰嗪絡(luò)合比色法檢測(cè)鐵螯合力，肽濃度用BCA法測(cè)定，洗脫峰收集液冷凍干燥后備用。

1.3.3.2 陰離子交換層析

稱取30 mg 1.3.1節(jié)冷凍干燥后的肽粉末溶解在1mL緩沖液C（0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液），上樣前經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾。色譜柱：Hitrap Q，柱體積：1 mL。上樣后用緩沖液C洗至基線平穩(wěn)，之后用緩沖液D（0.02 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，1.0 mol/L NaCl溶液）線性梯度洗脫：0～7 min，100% C；7～12 min，0%～25% D；12～42 min，65% D；42～47min，65%～100% D；47～49 min，100% D。流速1 mL/min，3 min/管，收集洗脫峰，調(diào)節(jié)洗脫峰收集液pH值到5.5后用菲啰嗪絡(luò)合比色法檢測(cè)鐵螯合力，肽濃度用BCA法測(cè)定，洗脫峰收集液冷凍干燥后備用。

1.3.3.3 凝膠過(guò)濾層析分離

洗脫條件參考GE HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution手冊(cè)的實(shí)驗(yàn)方法，利用相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)牛血清白蛋白（66 700 Da）、細(xì)胞色素C（12 400 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、乙氨酰乙氨酰乙氨酸（189 Da）進(jìn)行肽分子質(zhì)量的確定。取經(jīng)IMAC和陰離子交換色譜分離出的鐵螯合活性強(qiáng)的組分，冷凍干燥后用pH 7.3的0.01 mol/L磷酸緩沖液，0.15 mol/L NaCl緩沖液溶解后上樣。色譜柱：GE HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution，柱體積：120 mL，柱規(guī)格：600 mm×16 mm，流速0.8 mL/min，3 min/管。洗脫峰肽濃度用BCA法測(cè)定，收集鐵螯合能力最高峰洗脫液冷凍干燥后備用。

1.3.4 結(jié)構(gòu)解析

1.3.4.1 質(zhì)譜鑒定

將凝膠過(guò)濾層析鐵螯合活性強(qiáng)的組分用Bio-Rad脫鹽柱脫鹽，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，采用高效液相色譜系統(tǒng)分析鑒定。利用C18柱（100 μm×10 cm），通過(guò)Thermo LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜分析儀進(jìn)行分析。流動(dòng)相A：水（0.1%三氟乙酸）；流動(dòng)相B：乙腈（0.1%三氟乙酸），上樣量2 μL，洗脫流速240 μL/min。洗脫條件：0～10 min，98% A；10～45 min，98%～75% A；45～60 min，75%～10% A；60～69 min，10% A；69～70 min，10%～95% A；70～75 min，95%～98% A；75～100 min，98% A。質(zhì)譜結(jié)果用SEQUEST軟件進(jìn)行分析，SEQUEST軟件中輸出的兩個(gè)主要的分值分別為Xcorr與DeltCn，用Xcorr（+1、+2、+3）分別大于1.9、2.5、3.75，DeltCn大于0.1的過(guò)濾條件去掉不正確的鑒定結(jié)果。

1.3.4.2 酪蛋白鐵螯合肽的制備

將凝膠過(guò)濾層析鐵螯合活性強(qiáng)的組分用0.5 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到5.5，按肽與鐵質(zhì)量比4∶1添加FeCl2·4H2O，37 ℃螯合反應(yīng)60 min，結(jié)束后冷卻至室溫，冷凍干燥后保存[23]。

1.3.4.3 紫外光譜分析

取適量純化后酪蛋白多肽與酪蛋白鐵螯合肽冷凍干燥樣品，用磷酸緩沖液溶解（同時(shí)以磷酸緩沖液作為對(duì)照），在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)純化后酪蛋白多肽和鐵螯合肽進(jìn)行紫外光譜掃描，分辨率1 nm。

1.3.4.4 傅里葉變換紅外光譜分析

分別將純化后酪蛋白多肽與鐵螯合肽固體樣品2 mg放入瑪瑙研缽中，加入干燥的KBr（光譜純）200 mg混合研磨均勻（在紅外燈下進(jìn)行），使其粒度在2.5 μm以下，裝入壓片模具，抽氣加壓，28 MPa壓力下維持3～5 min，獲得透明的KBr樣品片，放入測(cè)定室內(nèi)，采用傅里葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm-1區(qū)間掃描，得到紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白鐵螯合肽分離結(jié)果

經(jīng)胰蛋白酶酶解2 h后用OPA法測(cè)得酪蛋白水解度為9.65%，之后分別用IMAC法和離子交換法分離酪蛋白粗肽（圖1），各得到兩個(gè)組分，分別為A1、A2和B1、B2，其中A1、B1未與填料結(jié)合，快速洗脫下來(lái)。測(cè)定洗脫峰收集液的肽含量和鐵螯合活性，IMAC分離組分A1、A2的鐵螯合活性分別為3.79、31.00 μg/mg，離子交換分離得到的組分B1和B2鐵螯合活性為0.67 μg/mg和16.94 μg/mg，IMAC的純化效果優(yōu)于離子交換，收集鐵螯合活性高的A2、B2冷凍干燥，待凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步分離。

圖1 酪蛋白多肽的IMAC（a）和離子交換（b）色譜圖Fig. 1 Immobilized metal affinity chromatography (a) and anion exchange chromatography (b) of casein peptides

經(jīng)IMAC和離子交換純化得到的組分A2和B2，通過(guò)Sephacryl S-100 HR凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)一步分離，A2分離得到3 個(gè)組分（A2-1、A2-2和A2-3，見圖2a），B2分離得到3 個(gè)組分（B2-1、B2-2和B2-3，見圖2b）。根據(jù)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝-0.025 7x+6.339 2，R2=0.996 8）凝膠過(guò)濾色譜圖出峰時(shí)間，可知A2-1、A2-2和A2-3分子質(zhì)量范圍為20～200 kDa、766～2 000 Da和100～766 Da，A2-1為未完全水解的酪蛋白，測(cè)定A2-1、A2-2和A2-3鐵螯合活性分別為26.62、39.56 μg/mg和4.17 μg/mg，A2-2與純化前粗肽相比，鐵結(jié)合量提高了3 倍。B2則主要分布在10～20 kDa范圍內(nèi)，其余組分肽含量較少，僅測(cè)定B2-2的鐵螯合活性為20.06 μg/mg。IMAC法與陰離子交換相比，與凝膠過(guò)濾層析結(jié)合后，對(duì)酪蛋白鐵螯合肽的分離效果優(yōu)于后者。IMAC法常用的一些離子為第1列過(guò)渡金屬離子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+，Swain等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Cu2+親和層析分離得到的牛肉蛋白多肽對(duì)鐵的溶解和吸收具有促進(jìn)作用，Bo[14]和Torres-Fuentes[23]等也曾先后使用Cu2+親和層析對(duì)乳鐵蛋白和鷹嘴豆鐵螯合肽進(jìn)行分離，本實(shí)驗(yàn)采用Cu2+分離得到的酪蛋白多肽同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的鐵螯合活性。因此多次洗脫收集A2-2組分，與氯化亞鐵螯合后冷凍干燥保存，待進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。純化前后螯合活性對(duì)比如表1所示。

圖2 Sephacryl S-100 HR凝膠過(guò)濾分離組分A2（a）和B2（b）的色譜圖Fig. 2 Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography of fraction A2 (a) and fraction B2 (b)

表1 純化前后鐵螯合肽活性Table 1 Iron chelating activities of crude and purified samples

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

組分A2-2用Bio-Rad脫鹽柱脫鹽后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析結(jié)果見表2。

表2 組分A2-2的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Identification of fraction A2-2 using LC-MS/MS

由表2可知，A2-2峰段物質(zhì)鑒定出3 種多肽氨基酸，其序列His-Ile-Gln-Lys-Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg（HIQKEDVPSER）、Ile-Thr-Val-Asp-Asp-Lys-His-Tyr-Gln-Lys（ITVDDKHYQK）和Thr-Arg-Leu-His-Pro-Val-Gln-Glu-Arg（TRLHPVQER），比對(duì)酪蛋白氨基酸序列可知，3 種多肽應(yīng)分別屬于αs1（95-105）-casein、αs2（86-95）-casein和牛乳黃嘌呤氧化酶多肽的肽段。本實(shí)驗(yàn)鑒定出的3 條肽段包含的氨基酸種類及其高頻率出現(xiàn)的氨基酸（Glu、Asp、His、Gln、Val）與其他相關(guān)研究基本一致。如大豆蛋白[16]、乳清蛋白[17,26]鐵螯合肽含有較多的Asp、Glu、Pro、Lys，阿拉斯加狹鱈皮多肽[24,27]中Ser、Cys、His含量較高，芝麻蛋白[28]水解物中Asn、Cys、Ser含量最高。Torres-Fuentes等[23]用Cu2+親和層析對(duì)鷹嘴豆鐵螯合肽進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)His與鐵螯合率呈正相關(guān)關(guān)系，His含量大于20%的組分鐵螯合率最高。

2.3 紫外光譜分析結(jié)果

圖3 酪蛋白多肽及其鐵螯合肽紫外吸收光譜圖Fig. 3 UV-Vis spectra of casein peptide and iron-peptide complex

由圖3可知，螯合前后多肽紫外吸收光譜發(fā)生變化，多肽溶液的最大吸光度在207 nm波長(zhǎng)處，加鐵螯合后的最大吸光度波長(zhǎng)為208 nm，產(chǎn)生了紅移，且吸收強(qiáng)度增加。此外，鐵螯合肽在275 nm波長(zhǎng)處吸收峰高度比多肽有明顯增高，結(jié)果與陸劍鋒等[29]螯合前后紫外吸收光譜相似，表明有新物質(zhì)生成，初步判斷酪蛋白多肽與鐵離子發(fā)生了螯合作用。

2.4 紅外光譜分析結(jié)果

由圖4可知，兩者在酰胺N—H伸縮振動(dòng)3 400 cm-1波數(shù)處和酰胺C＝O伸縮振動(dòng)1 650 cm-1波數(shù)處有明顯的吸收峰，而1 540 cm-1波數(shù)處的吸收由于N—H變形振動(dòng)引起，另外在1 200～1 000 cm-1波數(shù)間較大的吸收峰是由C—O—H的C—O伸縮振動(dòng)所引起。多肽在螯合后，羧基的伸縮振動(dòng)在1 407 cm-1波數(shù)的吸收峰轉(zhuǎn)移到1 444 cm-1波數(shù)，原位消失，變化與Chaud[30]、Huang Guangrong[31]等研究結(jié)果相似，可能是酪蛋白多肽與Fe2+螯合引起偏移和變化，而在其他波數(shù)處的吸收峰較為一致。此外，質(zhì)譜結(jié)果鑒定出的肽段中Glu、Asp、Gln含量較高，這3 種氨基酸的側(cè)鏈上均帶有C＝O鍵，推測(cè)其可能參與了螯合作用。

圖4 酪蛋白多肽及其酪蛋白鐵螯合肽傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectra of casein peptide and iron-peptide complex

3 結(jié) 論

酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解，采用IMAC、Sephacryl S-100 HR凝膠過(guò)濾分離得到的多肽鐵螯合活性強(qiáng)于陰離子交換與凝膠過(guò)濾層析的多肽鐵螯合活性。紫外、紅外光譜檢測(cè)表明，多肽與鐵發(fā)生螯合，羧基位點(diǎn)螯合前后發(fā)生變化。LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀對(duì)純化后的組分共鑒定出3 種多肽，其氨基酸序列分別為HIQKEDVPSER、ITVDDKHYQK和TRLHPVQER，3 條肽段中Glu、Asp、Gln出現(xiàn)頻率高，側(cè)鏈均含有C＝O鍵，推測(cè)多肽的羰基位是螯合鐵離子的主要位點(diǎn)。

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