循環(huán)凍融對蛋清蛋白性質(zhì)的影響

畢海丹，崔旭海，于 濱*，郭 瑩

（1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160；2.齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

雞蛋蛋清作為食品加工的重要配料應(yīng)用十分廣泛[1]，冰蛋白是規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用的主要形式。冰蛋白需要解凍后方能使用，蛋液重新凍結(jié)后仍可繼續(xù)貯藏，以便后續(xù)使用。在冰蛋白的使用過程中，水分出現(xiàn)凍結(jié)和融化交替發(fā)生的現(xiàn)象稱為循環(huán)凍融。循環(huán)凍融現(xiàn)象在食品貯藏和加工過程中較常見。國內(nèi)外已對水產(chǎn)品、肉制品、面制品的凍融現(xiàn)象進(jìn)行了豐富的研究。循環(huán)凍融促使鯉魚、魷魚、鱈魚蛋白和脂肪發(fā)生氧化，品質(zhì)下降[2-4]。循環(huán)凍融使牛肉蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，牛肉的嫩度和持水力降低[5]，循環(huán)凍融也會使雞肉、豬肉品質(zhì)下降[6-7]。凍融過程中，冰晶破壞了肉的超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致可溶性物質(zhì)濃縮，從而在細(xì)胞水平影響了生化反應(yīng)，改變了肉的品質(zhì)特性[8]。循環(huán)凍融會破壞麥谷蛋白結(jié)構(gòu)，降低其功能特性，影響餃子皮的品質(zhì)[9]。經(jīng)凍融的面筋蛋白添加到面粉中，凍融時間越長，面粉特性下降越明顯，這是由于面筋蛋白的二硫鍵在凍融過程中不斷解聚，降低了面筋蛋白分子質(zhì)量[10-11]。循環(huán)凍融對食品的營養(yǎng)、口感、風(fēng)味產(chǎn)生諸多影響[12]，多數(shù)研究者認(rèn)為循環(huán)凍融對蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)素起到破壞作用，降低了食品品質(zhì)。但Zhao Juyang等[13]卻發(fā)現(xiàn)大豆蛋白經(jīng)循環(huán)凍融后，蛋白質(zhì)分子間作用力發(fā)生變化，其凝膠特性得到改善。目前關(guān)于循環(huán)凍融對蛋制品性質(zhì)的影響卻少有研究。蛋清不同于肉制品、面制品、水產(chǎn)品等固態(tài)食品，其水分含量較高，成分相對單一，循環(huán)凍融使蛋白質(zhì)的性質(zhì)發(fā)生變化，但其變化規(guī)律是否與其他食品一致需要深入研究。

蛋清蛋白的主要成分包括卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類黏蛋白、溶菌酶等[14]，蛋清蛋白經(jīng)過剪切處理后，蛋白質(zhì)的功能性、結(jié)構(gòu)等均發(fā)生顯著變化[15]。循環(huán)凍融過程中存在的剪切、擠壓、濃縮等效應(yīng)，能夠改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、分子間作用力及理化性質(zhì)。Duan Xiang等[16]研究了循環(huán)凍融對蛋清泡沫性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)循環(huán)凍融能夠改善蛋清中各種蛋白的泡沫性質(zhì)，但是關(guān)于凍融過程中蛋清蛋白的理化性質(zhì)及凝膠特性沒有研究。本實驗以凍融處理的蛋清為研究對象，研究循環(huán)凍融過程中蛋清蛋白功能特性、理化性質(zhì)、流變特性及二級結(jié)構(gòu)的變化情況，確定循環(huán)凍融在冰蛋白的應(yīng)用過程中的作用，為冰蛋白保藏及在食品加工中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋購于濟(jì)南大潤發(fā)超市；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、8-苯氨基-萘酚-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma-Aldrich試劑公司；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus物性測試儀 英國Stable Micro System公司；Bohlin CVO旋轉(zhuǎn)流變儀 英國Malvern公司；TU1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4500熒光分光光度計 日立高新技術(shù)公司；AVATA360傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；90PlusPALS粒度分析儀 美國Brookhaven公司；BCD-290WDPK冰箱 海爾集團(tuán)；DF-101S磁力攪拌器 鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司；T18分散機(jī) 德國IKA公司；TGL-16B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；K9840自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清的循環(huán)凍融處理

取新鮮雞蛋若干，分蛋器分離蛋清與蛋黃，向蛋清中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的疊氮鈉，磁力攪拌器300 r/min攪拌15 min，用雙層紗布過濾蛋清，然后置于-20 ℃的冰箱中冷凍，12 h后取出，在30 ℃條件下解凍3 h，此為一個凍融過程，相同方法分別制備2～5 次循環(huán)凍融處理的蛋清。

1.3.2 功能性分析

1.3.2.1 蛋清凝膠特性的測定

取20 mL蛋清于50 mL燒杯中，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液或0.1 mol/L鹽酸溶液將蛋清pH值調(diào)至7.0，然后用保鮮膜密封，在90 ℃水浴中加熱30 min，取出后迅速冷卻。

在室溫條件下，使用物性儀測定凝膠硬度。物性儀的操作條件為：使用P/0.5的探頭，測試前速率5 mm/s，測試速率2 mm/s，測試后速率2 mm/s，下壓距離10 mm，停留時間2 s，觸發(fā)力5 g，測試凝膠硬度。

取一定質(zhì)量（W1）蛋清凝膠，在離心管中事先放入濾紙，然后在4 000 r/min離心20 min，取出凝膠用濾紙將表面水分吸干后稱質(zhì)量（W2），蛋清凝膠的持水性按公式（1）計算：

1.3.2.2 蛋清泡沫性質(zhì)的測定

調(diào)節(jié)蛋清pH值至7.0，利用分散機(jī)2 000 r/min攪打蛋清1 min。記錄未攪拌蛋清樣品溶液的體積（A），攪拌結(jié)束時蛋清泡沫的體積（B），攪拌結(jié)束30 min后蛋清泡沫體積（C）。起泡性和泡沫穩(wěn)定性按公式（2）、（3）計算：

1.3.2.3 蛋清溶解性的測定

將經(jīng)過循環(huán)凍融處理的蛋清于10 000 r/min離心10 min，使不溶物沉淀，取上清液以微量凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 理化性質(zhì)分析

1.3.3.1 巰基含量的測定

表面巰基的測定：向1 mL稀釋5 倍的蛋清中，加入4 mL、0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.5，含0.01 mol/L乙二胺四乙酸），40 ℃保溫30 min，加入125 μL的DTNB試劑（20 mg DTNB溶于5 mL 0.1 mol/L、pH 8.0的Tris-甘氨酸緩沖液），在25 ℃顯色10 min，測定波長412 nm處吸光度，以13 600/（mol·cm）消光系數(shù)計算巰基含量。

總巰基含量的測定：向1 mL稀釋25 倍的蛋清中，加入4 mL、0.1 mol/L的Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.5，含0.01 mol/L乙二胺四乙酸及8 mol/L尿素），其余測定方法與表面巰基測定方法相同。

1.3.3.2 表面疏水性

用0.02 mol/L，pH 7.4磷酸緩沖液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度在1～5 mg/mL之間，取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品4 mL，加入20 μL的ANS溶液（采用0.02 mol/L，pH 7.4磷酸緩沖液）作為熒光探針并于室溫條件下保持1 h。采用熒光分光光度計在370 nm的激發(fā)波長和470 nm的發(fā)射波長條件下測定樣品的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作曲線，曲線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性。

1.3.3.3 粒徑分布

取凍融后的蛋清溶液，用0.1 mol/L pH 7.6的磷酸緩沖液稀釋1 000 倍，0.45 μm微孔濾膜過濾后，利用激光粒度儀對樣品進(jìn)行粒徑分析。儀器操作條件：觀察角度為90°，測定波長為640 nm，折射指數(shù)為1.330，測量溫度為30 ℃。

1.3.4 流變特性分析

取循環(huán)凍融的蛋清液樣品置于流變儀載物臺與圓形平板之間，載物臺與平板間距為1 mm。采用0.l Hz的振動頻率振動樣品，應(yīng)變?yōu)?%，從25 ℃以1 ℃/min的速率升溫至90 ℃，測定樣品的彈性模量（G’）、黏性模量（G”）的變化。

1.3.5 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的測定

利用傅里葉紅外光譜儀全波段掃描400～4 000 cm－1，掃描次數(shù)32，采用OMNIC 6.0數(shù)據(jù)處理軟件處理原譜，用Peak Fit v 4.12軟件分析紅外光譜圖中屬于酰胺I帶1 600～1 700 cm－1特征峰的波段，校正基線后用Gaussian法去卷積，再利用二階導(dǎo)數(shù)法進(jìn)行多次擬合，計算各蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，采用SPSS Statistics進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，均數(shù)間比較采用Turkery檢驗進(jìn)行分析（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 循環(huán)凍融對蛋清功能性的影響

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)是指其在食品加工、貯藏和銷售過程中發(fā)生作用的那些物理化學(xué)性質(zhì)。食品工業(yè)中，蛋清蛋白較為重要的功能性質(zhì)包括溶解性、持水性、起泡性、凝膠性等[17]。本研究對循環(huán)凍融處理后的蛋清蛋白功能性質(zhì)進(jìn)行了測定，結(jié)果如表1所示。隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加，凝膠硬度、凝膠持水性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當(dāng)循環(huán)凍融2 次時，凝膠硬度和凝膠持水性分別達(dá)到556.06 g和72.94%，相對未凍融的蛋清提高了29.92%和35.22%。而經(jīng)過5 次循環(huán)凍融后，蛋清蛋白的凝膠硬度與凝膠持水性顯著（P＜0.05）降低到205.15 g和42.75%。Xia Xiufang等[18]發(fā)現(xiàn)豬肌原纖維蛋白的凝膠硬度隨著凍融次數(shù)增加而不斷下降，同時凝膠的其他質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)（彈性、黏性、內(nèi)聚性、持水性）也不同程度降低，認(rèn)為凍融處理破壞了蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，使得凝膠硬度與持水性都受到影響。而本研究中一定的循環(huán)凍融卻能提高蛋清的凝膠硬度與持水性，這可能與蛋清蛋白濃度較低，且為球蛋白有關(guān)，與Zhao Juyang等[13]的研究結(jié)論相似。

表1 循環(huán)凍融對蛋清蛋白功能性質(zhì)的影響Table 1 Effects of freeze-thaw cycles on functional properties of EWP

從表1可以看出，隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加，蛋清蛋白的起泡性提高。當(dāng)?shù)扒宓鞍變鋈谔幚? 次后，起泡性達(dá)到165.11%。而泡沫穩(wěn)定性卻呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，相對未處理蛋清，泡沫穩(wěn)定性均有不同程度的提高。冰晶的反復(fù)擠壓使得蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，有利于形成較強(qiáng)的表面張力，從而在氣-液界面吸附并形成堅韌的薄膜，使得凍融蛋清蛋白的起泡性不斷增加[9]。良好的溶解性是蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的重要保障，由表1可知，凍融處理降低了蛋清的溶解性，經(jīng)過2 次凍融后其溶解性變化顯著（P＜0.05）。在循環(huán)凍融過程中，蛋清蛋白分子受到冰晶分子的擠壓作用，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，變性程度與蛋白質(zhì)的種類及濃度有著密切聯(lián)系。疏水基團(tuán)的暴露會使蛋清蛋白的溶解性有所下降，從而導(dǎo)致泡沫穩(wěn)定性有所下降[19]。

2.2 循環(huán)凍融對蛋清蛋白理化性質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的具有空間結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，其理化性質(zhì)與功能性質(zhì)密切相關(guān)[20]。蛋白質(zhì)功能性的變化來源于其理化性質(zhì)的變化，因此本實驗對循環(huán)凍融的蛋清進(jìn)行了理化性質(zhì)分析，從而解釋蛋清蛋白功能性發(fā)生變化的原因，結(jié)果如表2所示。隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加，蛋清蛋白表面巰基含量不斷增加，而總巰基含量卻不斷降低，這表明在循環(huán)凍融過程中，反復(fù)形成的冰晶對蛋白質(zhì)進(jìn)行了擠壓，蛋白質(zhì)構(gòu)象同時也發(fā)生了兩方面的變化，一方面是蛋白質(zhì)分子部分展開，將原來包含于內(nèi)部的巰基暴露出來，另一方面游離的巰基在蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)形成了二硫鍵，使得總巰基含量下降[11,21]。在循環(huán)凍融過程中，蛋清蛋白的表面疏水性不斷增加，這主要是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸）暴露出來，從而體現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性[22]。隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加，蛋清溶液的平均粒徑不斷增加，主要是由于擠壓導(dǎo)致表面疏水性及表面巰基含量的增加，而濃縮作用又促進(jìn)了蛋白質(zhì)發(fā)生分子間聚集，這主要依賴于疏水相互作用以及分子間的二硫鍵來穩(wěn)定。但當(dāng)循環(huán)凍融為5 次時，平均粒徑稍有降低，這可能是由于冰晶的擠壓、剪切作用導(dǎo)致部分顆粒破碎。Noh等[23]也發(fā)現(xiàn)較大的冰晶能夠引起大豆蛋白結(jié)構(gòu)與粒度大小的變化，從而促進(jìn)大分子質(zhì)量的蛋白聚集體的形成。

表2 循環(huán)凍融對蛋清蛋白理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of freeze-thaw cycles on physicochemical properties of EWP

2.3 循環(huán)凍融對蛋清流變性能的影響

圖1 循環(huán)凍融蛋清蛋白流變特性隨溫度的變化Fig. 1 Changes in rheological properties of EWP with temperatures and freeze-thaw cycles

經(jīng)循環(huán)凍融后，蛋清蛋白加熱過程中，彈性模量（G’）、黏性模量（G’’）的變化情況如圖1所示。50～75 ℃是蛋白質(zhì)發(fā)生變性的主要區(qū)域，為清晰反映蛋清的流變特性，對50～75 ℃的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)坐標(biāo)并放大，從圖1插圖可以看出，在該溫度范圍內(nèi)，蛋清蛋白發(fā)生了2 次彈性模量與黏性模量的躍變。在55～65 ℃范圍內(nèi)，卵伴清蛋白發(fā)生變性聚集。在70～75 ℃范圍內(nèi)，蛋清中的卵白蛋白發(fā)生變性聚集[24]。在25～60 ℃范圍內(nèi)，未經(jīng)凍融處理及循環(huán)凍融1 次的蛋清呈現(xiàn)較低的彈性模量和黏性模量，隨著凍融次數(shù)的增加，蛋清的彈性模量與黏性模量不斷增加，這可能是由凍融處理后的蛋清蛋白分子間的疏水相互作用及二硫鍵加強(qiáng)所導(dǎo)致的。當(dāng)加熱溫度到達(dá)90 ℃時，循環(huán)凍融2 次的蛋清樣品呈現(xiàn)最大的彈性模量和黏性模量，其數(shù)值分別為5 982、5 874 Pa。終點(diǎn)彈性模量和黏性模量都是隨著凍融次數(shù)的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與上述凝膠特性的分析是一致的。在低于70 ℃的條件下，蛋清主要以液態(tài)形式存在，由于凍融處理增加了分子間相互作用，當(dāng)溫度高于70 ℃，蛋清蛋白發(fā)生凝固，主要以凝膠狀態(tài)為主，較大的分子間相互作用會降低凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的均一性，從而體現(xiàn)出隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加，蛋清的終點(diǎn)流變特性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

2.4 循環(huán)凍融對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

采用傅里葉紅外光譜對循環(huán)凍融處理的蛋清蛋白進(jìn)行分析，以期能從中獲得有用的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果如圖2所示。蛋白質(zhì)的紅外光譜中1 600～1 700 cm－1強(qiáng)而寬的吸收帶是由形成肽鍵的C＝O伸縮振動產(chǎn)生的，稱為酰胺I帶。酰胺I帶的振動頻率取決于C＝O和N—H之間的氫鍵性質(zhì)，即特征振動頻率反映了多肽或蛋白質(zhì)的特定二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲）。

圖2 循環(huán)凍融蛋清蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectra of EWP under different freeze-thaw cycles

將樣品的紅外光譜酰胺I帶進(jìn)行去卷積二階導(dǎo)數(shù)擬合處理，計算出擬合的各種構(gòu)象特征峰面積與總面積的比率，即為各二級結(jié)構(gòu)所占的百分比[25]，如表3所示。經(jīng)過循環(huán)凍融處理，蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加而分別減少了3.43%和4.71%，而β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量增加，這說明循環(huán)凍融處理破壞了維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)伸展，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)由有序結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序構(gòu)象[26]。循環(huán)凍融導(dǎo)致蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)變化與蛋白質(zhì)疏水性變化的結(jié)論是相一致的。

表3 循環(huán)凍融對蛋清蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Influence of freeze-thaw cycles on secondary structure of EWP%

3 討 論

本研究分析了循環(huán)凍融對蛋清蛋白功能性質(zhì)、理化性質(zhì)、流變性質(zhì)及結(jié)構(gòu)影響。蛋清蛋白經(jīng)過循環(huán)凍融后，其二級結(jié)構(gòu)受到破壞，空間結(jié)構(gòu)變得較為松散，使得內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來[27]，使蛋白質(zhì)表面疏水性隨著循環(huán)凍融次數(shù)的增加而增加。巰基是維持蛋清蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素，對于蛋白質(zhì)的功能性有重要影響[28]。隨著蛋白結(jié)構(gòu)的伸展，內(nèi)部巰基暴露出來，而總巰基減少，這表明已形成分子間的二硫鍵。這些二硫鍵的形成促使蛋白質(zhì)聚集，形成粒徑較大的蛋白質(zhì)聚集體。這些現(xiàn)象說明蛋清蛋白在凍融過程中發(fā)生了變性[29]。經(jīng)過凍融處理的蛋清蛋白具有較好的泡沫性，主要與蛋白質(zhì)疏水性增加密切相關(guān)[30]。蛋清蛋白結(jié)構(gòu)的適度伸展有利于提高其凝膠特性，而過度的凍融處理使得蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集，降低了凝膠特性及溶解性，不利于蛋清蛋白凝膠性的保持。分子間作用力的增加及蛋白質(zhì)聚集體的形成促使蛋清體現(xiàn)更高的彈性模量與黏性模量[31]，改變了蛋清蛋白流變特性。

4 結(jié) 論

本實驗研究了凍融循環(huán)過程中蛋清蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的變化。循環(huán)凍融使得蛋清蛋白結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)生分子間聚集，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)間的疏水相互作用，促進(jìn)二硫鍵的形成。這些結(jié)構(gòu)的變化改變了蛋清蛋白的理化性質(zhì)，從而體現(xiàn)出功能特性、流變特性的變化。但是蛋清液中含有多種蛋白質(zhì)及非蛋白組分，這些組分在循環(huán)凍融過程中的變化是否與蛋清液的變化趨勢一致，仍需進(jìn)一步研究探討。

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