LSD1在急性腎損傷腎纖維化中的保護作用及機制

趙晴，劉曉宇，劉航，楊海燕，徐巖

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266003)

急性腎損傷(AKI)是常見的臨床急重癥之一，研究證實部分AKI患者的腎功能未能完全恢復(fù)甚至最終進展至慢性腎臟病或終末期腎病，需長期腎臟替代治療[1]。小管間質(zhì)纖維化是急性腎損傷發(fā)展為慢性腎臟病的主要病理基礎(chǔ)[2]。TGF-β1在腎臟纖維化過程中起重要作用。組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)具有多種生物學(xué)功能，在乳腺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，LSD1可調(diào)控TGF-β1信號通路，從而影響細胞的增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[3]。但LSD1在急性腎損傷后腎纖維化中的作用尚不明確。2016年10月～2017年10月，我們研究LSD1過表達對急性腎損傷后纖維化進展的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD大鼠(體質(zhì)量約200 g，濟南悅鵬動物中心)；HK-2細胞株(上海細胞庫)；DMEM-F12細胞培養(yǎng)基(美國Hyclone)；胎牛血清(美國Gibco)；LSD1過表達質(zhì)粒(上海吉凱基因)；LSD1抗體、H3K4me1抗體、H3K4me2抗體、TGF-β1抗體、α-tubulin抗體、Ⅲ型膠原纖維(Col3α1)抗體(美國Abcam)；H3抗體(美國Cell signaling)；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000(美國Invitrogen)，缺氧培養(yǎng)裝置(美國Billups-Rothenberg公司)。

1.2動物分組及急性腎損傷模型構(gòu)建取健康雄性SD大鼠30只，隨機分為對照組、AKI1 d組、AKI1周組、AKI2周組、AKI4周組、AKI8周組，每組5只。AKI大鼠模型的構(gòu)建：腹腔注射氯碘酮(0.002 mL/g)麻醉SD大鼠，沿背部正中做一約1.5 cm縱形切口入腹腔，游離并切除左腎，游離右側(cè)腎蒂后用血管鉗夾閉40 min，打開血管夾，用37 ℃生理鹽水灌洗腹腔，關(guān)閉腹腔，分別于1 d、1周、2周、4周、8周后心臟采血后處死大鼠留取腎組織。對照組：同上述方法打開腹腔游離并切除左腎，不夾閉右側(cè)腎蒂，于8周后心臟采血后處死大鼠留取腎組織。

1.3細胞培養(yǎng)及缺氧培養(yǎng)HK-2細胞以含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12M培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。缺氧培養(yǎng)用無糖的DMEM培養(yǎng)基，置于含5%CO2、95%N2的缺氧裝置中37 ℃培養(yǎng)12 h，后換為正常培養(yǎng)基置于含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。

1.4LSD1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞將HK-2細胞分為4組：對照組、AKI組、AKI+空質(zhì)粒組、AKI+LSD1過表達組，對照組未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，AKI組缺氧培養(yǎng)，AKI+空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒后缺氧復(fù)氧培養(yǎng)，AKI+LSD1過表達組轉(zhuǎn)染LSD1質(zhì)粒后缺氧復(fù)氧培養(yǎng)。將HK-2細胞種植于六孔板上，以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞密度75%，換為不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，按照Lipofectamine3000說明書進行轉(zhuǎn)染，4 h后換為正常培養(yǎng)基，12 h后進行缺氧培養(yǎng)或正常培養(yǎng)。

1.5大鼠腎組織中TGF-β1、LSD1、Ⅲ型膠原(Col3)α1蛋白表達檢測采用蛋白免疫印跡法。收集腎組織及細胞，提取總蛋白，以BCA法定量，取總蛋白量20 μg的細胞及組織裂解液以10%SDS-PAGE電泳分離，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。以5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，PBST洗膜3次，每次洗15 min，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，每次15 min，用化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce)應(yīng)用VILBER Fusion FX7成像系統(tǒng)進行顯影。

1.6TGF-β1基因啟動子上H3K4me1及H3K4me2表達檢測采用染色體免疫共沉淀(ChIP)法。用甲醛使細胞體內(nèi)的蛋白和染色體交聯(lián)，超聲3次使核膜碎裂，測DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段大小。向待測樣品中分別加入1∶50稀釋的H3K4me1、H3K4me2和陰性對照抗體IgG，于轉(zhuǎn)子上4 ℃孵育過夜。利用ChIP緩沖液和磁珠將染色質(zhì)從蛋白上洗脫并解交聯(lián)，用離心柱純化DNA，將純化后的DNA進行RT-PCR。TGF-β1激動子:正向引物:5′-ATCCCGGTGGCATACTGAG-3′，反向引物:5′-CACGGAACTTCGGAGAGC-3′。結(jié)果以相對于陰性對照抗體的倍數(shù)呈現(xiàn)。

2　結(jié)果

2.1大鼠急性腎損傷后TGF-β1及LSD1表達變化 對照組、AKI 1 d組、AKI 1周組、AKI 2周組、AKI 4周組、AKI 8周組TGF-β1蛋白相對表達量分別為0.25±0.03、0.28±0.02、0.41±0.03、0.65±0.03、0.75±0.02、0.56±0.03，LSD1蛋白表達量分別為0.42±0.04、0.43±0.05、0.65±0.05、0.97±0.04、1.15±0.08、0.88±0.06。與對照組相比，AKI 1d組TGF-β1蛋白表達量無明顯變化，AKI 1、2、4、8周組 TGF-β1蛋白表達量較對照組均有不同程度升高(P均<0.05)，AKI 4周組TGF-β1蛋白表達升高最明顯。同樣與對照組相比，AKI 1、2、4、8周組LSD1蛋白表達均增高(P均<0.05)，且AKI 4周組升高最明顯，與TGF-β1升高趨勢相同。

2.2各組大鼠腎組織中Col3α1蛋白表達比較 對照組、AKI 1 d組、AKI 1周組、AKI 2周組、AKI 4周組、AKI 8周組Col3α1蛋白相對表達量分別為0.99±0.16、1.16±0.10、1.23±0.06、1.32±0.07、1.75±0.10、1.54±0.08;與對照組相比，AKI 1、2、4、8周組大鼠腎組織中Col3α1蛋白表達增多(P均<0.05)，AKI 4周組增加最明顯，而AKI 1d組Col3α1表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.3各組大鼠腎組織中H3K4甲基化表達量比較對照組、AKI 1 d組、AKI 1周組、AKI 2周組、AKI 4周組、AKI 8周組H3K4me1蛋白相對表達量分別為0.61±0.08、0.62±0.04、1.06±0.15、2.06±0.12、2.79±0.12、1.88±0.19，H3K4me2蛋白相對表達量分別為0.65±0.04、0.63±0.04、0.61±0.06、1.14±0.09、1.49±0.08、0.73±0.05。與對照組相比，AKI 1、2、4、8周組 H3K4me1均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，H3K4me2變化不如H3K4me1顯著，但與對照組相比，AKI 2及AKI 4周組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。且H3K4甲基化的變化趨勢與LSD1一致，均在AKI后4周時升高最明顯。

2.4各組HK-2細胞H3K4me1及H3K4me2蛋白表達量比較對照組、AKI組、AKI+空質(zhì)粒組、AKI+LSD1過表達組H3K4me1蛋白相對表達量分別為1.11±0.04、1.72±0.04、1.67±0.04、0.59±0.04， H3K4me2蛋白相對表達量分別為1.63±0.06、1.94±0.07、2.00±0.07、1.28±0.06。與對照組相比，AKI組及AKI+空質(zhì)粒組H3K4me1及H3K4me2表達量均增加(P均<0.05)。與AKI組及AKI+空質(zhì)粒組相比，LSD1過表達組H3K4me1及H3K4me2表達量下降(P均<0.05)。

2.5各組HK-2細胞纖維化相關(guān)蛋白表達量比較 對照組、AKI組、AKI+空質(zhì)粒組、AKI+LSD1過表達組Col3α1蛋白相對表達量分別為0.59±0.04、1.22±0.05、1.18±0.04、0.68±0.05，與對照組相比，AKI組及AKI+空質(zhì)粒組Col3α1表達增加(P均<0.05)，但兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與AKI組及AKI+空質(zhì)粒組相比，AKI+LSD1過表達組Col3α1表達明顯下降，組間比較,P均<0.05。

2.6各組HK-2細胞LSD1、TGF-β1mRNA及蛋白相對表達量比較對照組、AKI組、AKI+空質(zhì)粒組、AKI+LSD1過表達組LSD1 蛋白相對表達量分別為0.53±0.05、0.83±0.04、0.84±0.04、1.52±0.04，TGF-β1蛋白相對表達量分別為0.67±0.05、1.12±0.05、1.05±0.05、0.67±0.05。與對照組相比，AKI組、AKI+空質(zhì)粒組TGF-β1表達增加(P均<0.05)，與AKI組及AKI+空質(zhì)粒組相比，AKI+LSD1過表達組TGF-β1表達下降(P均<0.05)。

2.7各組HK-2細胞TGF-β1啟動子上組蛋白表達比較對照組、AKI組、AKI+空質(zhì)粒組、AKI+LSD1過表達組TGF-β1啟動子上H3K4me1表達量分別為0.33±0.07、3.27±0.34、3.42±0.39、0.69±0.10，H3K4me2表達量分別為0.19±0.02、1.80±0.07、1.87±0.06、0.45±0.11。與對照組相比，AKI組及AKI+空質(zhì)粒組TGF-β1啟動子上H3K4me1及H3K4me2表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，而兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與AKI及AKI+空質(zhì)粒組相比，LSD1過表達組TGF-β1啟動子上H3K4me1及H3K4me2表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

3　討論

急性腎損傷后正常腎臟組織可通過修復(fù)機制恢復(fù)正常的腎功能，但如果修復(fù)機制受損、損傷較重或?qū)е聯(lián)p傷的因素持續(xù)存在，便會導(dǎo)致不可逆的組織重塑及纖維化，進展為慢性腎損傷。急性腎損傷后機體通過自分泌或旁分泌途徑激活間質(zhì)成纖維細胞及小管上皮細胞等細胞，導(dǎo)致以膠原為主的細胞外間質(zhì)生成過多，形成腎臟纖維化[4]。

越來越多的證據(jù)表明纖維化過程中染色體表觀遺傳標志物H3K4me表達增加，組蛋白H3K4甲基化可促進TGF-β1的表達，進而促進纖維化過程的進展[5,6]。在黃素腺嘌呤二核苷酸的參與下，LSD1可特異去除組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4) 的二甲基和一甲基修飾[7]。同時LSD1具有多種生物學(xué)功能，可作用于包括各種轉(zhuǎn)錄因子、p53及Dnmt1 蛋白等，從而在基因表達的調(diào)控中起重要作用[8～10]。近年來LSD1在腫瘤中的研究甚多，研究證實LSD1在乳腺癌中可調(diào)控TGF-β1信號途徑，進而調(diào)控細胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生過程[13]。而在腎臟纖維化中，LSD1是否可通過使H3K4去甲基化減輕腎纖維化進展尚少見報道，為此該研究設(shè)計了急性腎損傷后腎纖維化模型，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使LSD1過表達，進而研究LSD1對腎臟纖維化的影響。

Col3是細胞外基質(zhì)的重要組成成分，是纖維化發(fā)生的標志。本研究制作了缺血再灌注的AKI大鼠模型，并觀察到AKI后大鼠腎組織中細胞外基質(zhì)重要成分Col3α1表達增加證實了AKI后大鼠腎臟確實發(fā)生了纖維化。本研究同時觀察到AKI后纖維化過程中H3K4me1及H3K4me2表達均增加，但H3K4me2變化不如H3K4me1變化顯著，而與預(yù)期結(jié)果相反，H3K4甲基化增加的同時LSD1表達也增加，本研究考慮LSD1是纖維化過程中機體的保護因子，LSD1表達增加是機體為減輕組蛋白甲基化的自我保護機制。在細胞實驗中，LSD1過表達后，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理的AKI HK-2細胞較正常表達LSD1的HK-2細胞纖維化指標明顯下降，從而證實LSD1可減輕AKI后腎纖維化的進展。

大量研究證實TGF-β1是AKI后腎纖維化過程中的核心因子，炎癥過程中巨噬細胞產(chǎn)生大量TGF-β1，TGF-β1可啟動經(jīng)典途徑及非經(jīng)典途徑，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，其中Smad信號途徑是TGF-β1致腎臟纖維化作用的主要信號途徑。纖維化過程中Smad3高度活化，活化的Smad3可使抑制性的Smad7下調(diào)，Smad3和Smad7的失調(diào)會導(dǎo)致肌成纖維細胞的活化和聚積，使細胞外基質(zhì)生成過多、降解下降，導(dǎo)致腎臟纖維化進展[12,13]。該研究觀察到AKI后各組TGF-β1表達較對照組明顯增加，其變化趨勢與LSD1變化趨勢一致，而在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)LSD1過表達可使AKI細胞TGF-β1表達下降。本研究發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷后TGF-β1啟動子上H3K4me1及H3K4me2表達增加，而LSD1過表達可使TGF-β1啟動子上H3K4me1及H3K4me2表達下降。因此我們推測，LSD1通過使H3K4me1及H3K4me2去甲基化抑制TGF-β1表達，從而減輕AKI后腎纖維化進展。

綜上所述，LSD1可通過使H3K4me1及H3K4me2發(fā)生去甲基化，使TGF-β1表達下降，從而在AKI后腎纖維化過程中起保護作用。

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