高內(nèi)涵篩選在分子機制研究中的應(yīng)用

李廷躍 吳帆

暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣州紅十字會醫(yī)院/廣州紅十字會醫(yī)院普通外科（廣州 510220）

高內(nèi)涵篩選（high content screening，HCS）是一種以細胞為檢測對象，通過顯微成像法記錄多孔板內(nèi)細胞的圖像并通過分析圖像中的信息來解析細胞內(nèi)物質(zhì)活動的技術(shù)工具［1］。該技術(shù)系在高通量篩選（high throughput screening，HTS）技術(shù)興起后逐步發(fā)展而來，主要依賴于高分辨率的細胞成像系統(tǒng)，充分整合樣品制備技術(shù)、自動化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、檢測試劑、生物信息學(xué)等資料的優(yōu)勢，在細胞或分子水平上實現(xiàn)對細胞信號發(fā)送、信號傳導(dǎo)、信號接收及相關(guān)一系列反應(yīng)的成像、分析及篩選［1］。HTS技術(shù)結(jié)果單一［2］，而HCS技術(shù)可在保持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整的條件下，同時監(jiān)測被篩選藥品對細胞生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個環(huán)境的影響，涉及膜受體、胞內(nèi)成分、細胞器和離子通道等眾多靶點，從而能夠得到多方面的篩選結(jié)果［3］。由此可見，HCS技術(shù)可從單一實驗中獲得大量分子機制相關(guān)的信息，從而在近年來的分子機制研究中得到了廣泛應(yīng)用。

1 實現(xiàn)小規(guī)模向大規(guī)模細胞生物學(xué)研究的飛躍

高內(nèi)涵篩選未出現(xiàn)之前，運用熒光顯微技術(shù)進行細胞生物學(xué)研究仍處于小規(guī)模時期。所謂小規(guī)模細胞生物學(xué)的定義，即指運用顯微成像系統(tǒng)從較少數(shù)量的實驗樣品中收集圖像數(shù)據(jù)［4］。通常每份實驗樣品的細胞總數(shù)為10～1 000個。這些系統(tǒng)需要大量的人工操作以滿足以下4個條件：（1）維持最理想的光照；（2）試驗裝置和裝載細胞進入小的試驗環(huán)境；（3）集中掃描；（4）圖像采集、顯示、加工、分析。由于對手工或從圖像半自動數(shù)據(jù)析取的數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的信息的處理是一個密集型勞動的過程，故想從這些實驗中產(chǎn)生新的知識，需要在數(shù)周甚至數(shù)月的時間里完成許許多多小規(guī)模實驗。這往往需要耗費大量的人力物力。再者，雖然這樣的小規(guī)模細胞生物學(xué)實驗有助于深刻理解細胞分子功能，但這些實驗的利用率很低，嚴重影響實驗研究的進展甚至限制實驗的繼續(xù)進行。而這樣的研究之所以只能在小規(guī)模范圍內(nèi)完成，主要是因為以往的細胞生物學(xué)試驗尚未能實現(xiàn)自動化（如無法進行自動化分析設(shè)計、圖像采集、數(shù)據(jù)存儲等等）［5］。

但隨著高內(nèi)涵篩選的出現(xiàn)，它將定量的熒光顯微技術(shù)施之于自動化的細胞生物學(xué)實驗，使得大規(guī)模細胞生物學(xué)研究成為可能。而且，在高內(nèi)涵篩選的支持下，大規(guī)模細胞學(xué)實驗學(xué)已取得不少成就。高內(nèi)涵篩選是一項研究多個細胞陣列中所包含的豐富的細胞生物學(xué)信息的自動化技術(shù)。其自動化過程涵蓋了實驗設(shè)計的關(guān)鍵環(huán)節(jié)、樣品制備、圖像采集、歸檔、處理、分析以及細胞信息發(fā)掘等多個過程，達到了真正意義上的“高內(nèi)涵”?！案邇?nèi)涵”即指細胞在結(jié)構(gòu)和功能完整的情況下，其生長分化等過程中的所有信息。

大規(guī)模生物學(xué)實驗同樣包括了若干變量的不同，比如細胞種類、基質(zhì)的化學(xué)過程、競爭者或者對抗者的濃度、治療時間、每個實驗細胞參數(shù)的種類、時間點的計數(shù)和頻率等。在這些實驗中，通過使用完整細胞制成的高度相關(guān)的測量工具可以快速地分析其路徑。甚至，在群體里面的每個真實獨立的個體的多種細胞活動都可以被檢測到［6］。即活的細胞實驗所提供的機制學(xué)研究需要的細節(jié)完全不受影響，效果顯著。另外，通過這種大規(guī)模細胞生物學(xué)試驗，還可以快速地了解到，某個特定細胞過程中整個生物體水平的表型變化［7］。

高內(nèi)涵篩選使大規(guī)模細胞生物學(xué)成為可能［4］，從而使得機制學(xué)的研究變得更加便捷，進而給予分子機制研究必要的條件及助力。如借助高內(nèi)涵篩選可得到抑制或促進蛋白質(zhì)表達的某些目的基因，進而達到實現(xiàn)研究分子機制的目標(biāo)。其目標(biāo)包括尋找到?jīng)Q定路徑的組件、決定給出的路徑所在的細胞生理過程的先后順序、證實治療方案的分子靶點等等。

2 HCS將分子機制研究帶入一個更深的研究層次

蛋白質(zhì)組學(xué)和細胞組學(xué)研究依賴于分析生物化學(xué)事件中的分子視野。而這些分子視野的獲得則需要依賴先進的定量顯微技術(shù)，如熒光壽命成像顯微技術(shù)（fluores?cence lifetime imaging microscopy，F(xiàn)LIM）和福斯特共振能量轉(zhuǎn)移成像（forster resonance energy transfer imaging，F(xiàn)RE?TI）。分子水平檢測到的光譜信息，可用于估計細胞形態(tài)、分析細胞定位、識別分子或細胞亞群。由此，獲取特定環(huán)境下細胞對化學(xué)和物理刺激反應(yīng)的分子機制成為可能，即自動化熒光壽命成像顯微設(shè)置的無人監(jiān)管操作和成像分析可與這些技術(shù)所提供的高內(nèi)涵相結(jié)合，進而對細胞反應(yīng)的分子機制進行分析。

過去10年的研究已證明，F(xiàn)RETI和FLIM技術(shù)對單個細胞中生物化學(xué)狀態(tài)的定量成像起著重要作用。這些成像方法有助于對不同細胞總體進行分析。定量多參數(shù)顯微技術(shù)是一個非常年輕的領(lǐng)域。在該領(lǐng)域中，不斷進步的液態(tài)樣品處理機器人技術(shù)和信息技術(shù)正逐漸集成到自動化的顯微技術(shù)中，并通過自動化和無監(jiān)督操作將高內(nèi)涵圖像信息與高通量容量合二為一。

高內(nèi)涵應(yīng)用程序主要用來對影響細胞行為的物質(zhì)或條件進行定量和多參數(shù)分析。舉例來講，對疾病分子機制的理解就需要高分辨率的信息，因為它篩選的目標(biāo)是細胞和（或）亞細胞水平的。高內(nèi)涵應(yīng)用程序旨在監(jiān)測分子路徑：如生物分子的定位、相互作用以及它們對藥物或病原體的反應(yīng)等。無人監(jiān)管的自動熒光壽命成像技術(shù)為可升級篩選平臺提供了基礎(chǔ)，使高通量水平和高內(nèi)涵篩選得以合而為一，推動了分子機制研究朝更深層次邁進［8］。

3 HCS涉及廣闊的研究領(lǐng)域

3.1 HCS和細胞信號傳導(dǎo) 在藥物研發(fā)進程中，了解環(huán)境因素如何觸發(fā)特定的生物學(xué)瀑布式反應(yīng)是治療控制的關(guān)鍵。因此，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是篩選靶向藥物的主要來源。而借助HCS可以更好地理解新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)通過怎樣的途徑發(fā)揮作用［9］，進而為藥物研發(fā)提供方向和依據(jù)。

3.2 HCS和腫瘤學(xué) HCS技術(shù)很早就被用于檢測細胞凋亡和增殖，從而使其在腫瘤研究中占據(jù)了一席之地。實際上，HCS技術(shù)對細胞周期，轉(zhuǎn)化和遷移的檢測中也具有重要作用。比如，通過改變HCS應(yīng)用程序中的自動力試驗算法并采用相應(yīng)的試劑盒，HCS便可用于評估腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力，甚至觀察單個細胞的變化規(guī)律，有助于更好的理解抗腫瘤化合物如何與眾不同地影響癌細胞［10］以及檢測出腫瘤生物標(biāo)記物的功能。

3.3 HCS和神經(jīng)生物學(xué) 在HCS的早期發(fā)展中，人們意識到成像技術(shù)在神經(jīng)元形態(tài)定量上具有較大的應(yīng)用潛能，因此HCS技術(shù)最早被運用于監(jiān)控神經(jīng)突的增長。如今，HCS在各種各樣的神經(jīng)疾病狀態(tài)的研究中應(yīng)用非常廣泛。無論是對生物學(xué)的基礎(chǔ)研究、新模型的構(gòu)建，抑或是用于干預(yù)治療的小分子的篩選，HCS都有著廣泛的應(yīng)用，其應(yīng)用實例包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化以及日益增多的腦癌研究等［11］。

3.4 HCS和體外毒性 從某種程度上來講，不論體外毒性是與周圍環(huán)境還是與化學(xué)因素有關(guān)，考慮到HCS技術(shù)觀察的是細胞對刺激的表型反應(yīng)，因此所有HCS試驗均可被視為“毒性”試驗。從相對簡單的精確毒性測量，如細胞計數(shù)和細胞變圓，到更加特別的細胞健康的測量，HCS可以被應(yīng)用于多種“毒性”研究中，尤其可在多重端點歸一化的多參數(shù)試驗中幫助定義微妙的毒性狀態(tài)［12］。

高內(nèi)涵篩選在分子機制研究中涉及的種種領(lǐng)域以及其過程中所產(chǎn)生的思考和思路，直接或間接使得分子機制研究變得更為多樣化和全面化，同時也為分子機制研究提供了多重研究靈感及價值［13］。

4 高內(nèi)涵篩選在肝癌靶向治療研究中的作用

4.1 背景 肝癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一。根據(jù)全球癌癥狀況最新數(shù)據(jù)（Globocan 2012）的估計，肝癌已經(jīng)位居全球惡性腫瘤死亡的第2位，2012年全球肝癌死亡病例約為74.6萬例，其中超過50%的肝癌死亡病例發(fā)生于我國［14］。盡管近年來肝癌手術(shù)切除率已明顯提高，肝癌的治療手段已趨于多樣化，但因臨床發(fā)現(xiàn)的肝癌仍以中晚期肝癌為主，這些患者發(fā)現(xiàn)時往往已無手術(shù)機會，但又缺乏有效的綜合治療手段，從而限制了肝癌整體治療水平的進一步提高［15］。近年來，以索拉菲尼為主要代表的分子靶向治療成為肝癌綜合治療領(lǐng)域中的重要進展［16］。但索拉菲尼往往在短期治療后即產(chǎn)生耐藥，且其耐藥機制目前尚不清楚，導(dǎo)致這一問題的原因可能就在于索拉菲尼本身發(fā)揮治療作用的分子機制目前尚不明確，由此可見，進一步篩選潛在的肝癌治療靶點并闡明其增殖凋亡作用機制，是提高肝癌靶向治療療效以及進一步提高肝癌整體治療水平的關(guān)鍵［17-18］。

4.2 應(yīng)用 高內(nèi)涵篩選借助高分辨率的細胞成像系統(tǒng)，充分整合樣品制備技術(shù)、自動化設(shè)備、數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)、檢測試劑及生物信息學(xué)等方面的優(yōu)勢，在細胞或分子水平上實現(xiàn)對細胞信號發(fā)送、信號傳導(dǎo)、信號接收及相關(guān)一系列反應(yīng)的成像、分析及篩選，可以在短期內(nèi)識別大量基因、蛋白的作用。相較于傳統(tǒng)的細胞遷徙篩選方法如侵襲小室侵襲和劃痕愈合試驗，HCS可直接在細胞芯片層面上對細胞行為進行調(diào)查研究，從而篩選出一個與肝癌有關(guān)的基因庫，而且識別出涉及肝癌增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為相關(guān)的基因：如LI等［19］近期采用高內(nèi)涵篩選證實了AEG?1和AKRIC2這兩個在肝癌遠處轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因，從而為肝癌轉(zhuǎn)移的靶向治療研究提供了新的候選靶點。筆者最近也將高內(nèi)涵篩選技術(shù)應(yīng)用于肝癌潛在治療靶點Mus81基因的分子作用機制研究。筆者前期通過基因芯片得到了數(shù)百個與Mus81基因中可能相關(guān)的差異表達基因，接著通過生物信息學(xué)分析及高內(nèi)涵篩選，從這數(shù)百個差異基因中篩選出數(shù)個與肝癌增殖相關(guān)的基因，并最終鑒定得到了Mus81的關(guān)鍵下游基因——STC2［20］，從而為針對Mus81基因進行肝癌靶向治療研究提供了新的理論依據(jù)。

4.3 其他 高內(nèi)涵篩選加快了腫瘤學(xué)行為機制研究的速度［21］。它既可鑒定誘導(dǎo)腫瘤細胞生長過程中有絲分裂停止的小分子，也可篩選出候選的腫瘤抑制基因［22］，為了解腫瘤細胞癌變前的生理機制及相關(guān)抑制機制提供重要依據(jù)。同時，借助多參數(shù)的高內(nèi)涵篩選平板、可視化數(shù)據(jù)和表型分類方法，可詳細地解釋個體復(fù)合效應(yīng)和大量收集到的多個參數(shù)的細胞反應(yīng)，從而為肝癌的靶向治療提供基礎(chǔ)。

綜上所述，HCS技術(shù)在分子機制研究中具有重要作用，其研究對象也已不再局限于小型生物分子，而是逐步擴大到蛋白質(zhì)、小分子肽類等大分子。如分析Rab蛋白在高爾基前體退化的追蹤作用［23］、鑒定肝細胞內(nèi)控制脂肪小滴形成和生長的小分子核糖核酸等［24］。隨著HCS技術(shù)的飛速發(fā)展及人們對該技術(shù)的不斷改進提高，如AMSBIO公司分析細胞侵襲的新型3D培養(yǎng)96孔基底膜提取板、Arte?mis公司的QS14熱電的冷卻CCD相機、Greiner Bio?One公司的96孔玻璃底微孔板等的開發(fā)［25］，因而可以想見，其在分子機制研究中的應(yīng)用也將愈加豐富多彩。

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