中國荷斯坦牛CSN3基因多態(tài)性及其與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性

胡 言，桂林生，余橫偉，Haider Abbas Raza，昝林森,2(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌7200；2現(xiàn)代牛業(yè)生物技術(shù)與應(yīng)用國家地方聯(lián)合工程研究中心，陜西 楊凌7200)

泌乳性狀的選育是奶牛育種的重要內(nèi)容之一，因?yàn)槠渲苯記Q定著奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。乳成分包括乳脂、乳蛋白以及乳糖等，而乳蛋白分為酪蛋白(Casein)和乳清蛋白兩大類[1]，其中酪蛋白含有大量的鈣和磷，屬于特有的一種磷蛋白，按照生化性質(zhì)分為αs1酪蛋白(CSN1S1)、αs2酪蛋白(CSN1S2)、β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)和γ酪蛋白(γ Casein)5種亞型[2]。牛CSN3基因位于第6號染色體上，基因全長2 554 bp，含1個(gè)外顯子，其中編碼序列(Coding sequence，CDS)長483 bp。有研究證實(shí)，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因在牛6號染色體q31～33位置上緊密連鎖[3]，顯著影響牛奶中的乳蛋白率、乳脂率和產(chǎn)奶量等性狀[4]。

在山羊上的研究發(fā)現(xiàn)，CSN3基因多態(tài)性與產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)、繁殖力等有一定的相關(guān)性[5]。在小鼠模型上，敲除CSN3基因后發(fā)現(xiàn)，盡管其它酪蛋白表達(dá)量未發(fā)生變化，但母鼠卻喪失了泌乳能力，說明CSN3基因在泌乳過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6]。此外，κ酪蛋白是大部分哺乳動物中唯一的糖基化酪蛋白，水解后產(chǎn)生的配糖巨肽可以預(yù)防胎兒對外源性蛋白過敏[7]，還能為其提供氨基酸和碳水化合物[8]。

牛CSN3基因位于第6號染色體上，基因全長2 554 bp，含1個(gè)外顯子?；贑SN3基因在泌乳過程中的重要調(diào)控功能，本研究采用DNA測序法，對565頭中國荷斯坦牛CSN3基因進(jìn)行群體變異檢測分析，將檢測到的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)與中國荷斯坦牛的泌乳性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，同時(shí)分析不同雙倍型對中國荷斯坦牛泌乳性狀的影響，以期為中國荷斯坦牛分子育種提供新的理論方法和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 血液采集及泌乳性狀指標(biāo)的獲取

供試血樣采自陜西省華陰市的西安草灘牧業(yè)有限公司華陰奶牛一場。采樣時(shí)，隨機(jī)選擇健康的中國荷斯坦牛母牛565頭，每頭牛尾靜脈采血10 mL，樣品采集完畢后置于-80 ℃保存。荷斯坦牛胎次信息及DHI數(shù)據(jù)均來自采樣牛場資料庫，本試驗(yàn)選用DHI指標(biāo)包括乳脂率、乳蛋白率及乳糖率。

1.2 中國荷斯坦牛CSN3基因的PCR擴(kuò)增

外顯子區(qū)域的SNP可能會引起氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響基因的翻譯；3′UTR區(qū)域SNP可能改變MicroRNA結(jié)合，導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變。故本試驗(yàn)針對CSN3基因外顯子和3′UTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物。根據(jù)GenBank公布的牛CSN3基因序列(GenBank登錄號：NM_174294.2),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，交由上海生工生物工程股份有限公司合成。由于CSN3基因3′UTR區(qū)域全長2 071 bp，無法一次進(jìn)行擴(kuò)增，因此設(shè)計(jì)2對引物進(jìn)行分段(3′UTR1和3′UTR2)擴(kuò)增。

表1 CSN3基因引物序列信息Table 1 Sequence information of primers for CSN3 gene

使用TIANamp Blood DNA kit試劑盒(天根，北京)提取DNA。DNA質(zhì)量和濃度分別采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行檢測。CSN3基因PCR反應(yīng)體系為30.0 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix共計(jì)15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上、下游引物各(10 pmol/μL)0.6 μL,模板DNA(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.3 SNP檢測

將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化并測序，測序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行對比分析，篩選突變位點(diǎn)。本試驗(yàn)中的CSN3基因3′ UTR區(qū)域所擴(kuò)增的2個(gè)片段分別獨(dú)立分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CSN3基因外顯子和3′ UTR的PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

圖1、2為CSN3基因外顯子、3′ UTR1和3′ UTR2的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其片段長度分別為375，905和511 bp。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，特異性較好，可以用于后續(xù)測序分析。

M.DNA Marker;1,2.外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker;1,2.PCR product of exon圖1 中國荷斯坦牛CSN3基因外顯子PCR產(chǎn)物的電泳檢測Fig.1 Electrophorogram of PCR product of exon1 in CSN3 gene of Chinese Holstein Cattle

M.DNA Marker;1,2.3′ UTR1;3,4.3′ UTR2圖2 中國荷斯坦牛CSN3基因3′ UTR分段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測Fig.2 Electrophorogram of PCR product of 3′ UTR in CSN3 gene of Chinese Holstein Cattle

2.2 CSN3基因多態(tài)位點(diǎn)的遺傳學(xué)分析

通過測序分析發(fā)現(xiàn)，CSN3基因外顯子上存在1個(gè)SNP位點(diǎn)，為g.463A>G(圖3-A);在3′UTR區(qū)域存在3個(gè)SNPs，分別是g.1012A>C(圖3-B)、g.2015T>A(圖3-C)和g.2396A>T(圖3-D)，盡管這3個(gè)SNP位點(diǎn)均不能改變氨基酸結(jié)構(gòu)(同義突變)，但可能改變MicroRNA結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄活性發(fā)生變化，因此具有一定的研究價(jià)值。

圖3 中國荷斯坦牛CSN3基因突變區(qū)域基因型突變序列比對Fig.3 Sequencing comparison between different genotypes of mutational regions of CSN3 gene in Chinese Holstein cattle

本研究分析了這4個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量等遺傳指標(biāo)，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)檢測Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，結(jié)果見表2和表3。表2顯示，CSN3基因g.463A>G處，GG為優(yōu)勢基因型；g.1012A>C處，CC是優(yōu)勢基因型；g.2015T>A處，AA為優(yōu)勢基因型；g.2396A>T處，TT為優(yōu)勢基因型。表3顯示，g.463A>G和g.2015T>A位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(HWE<5.991)；4個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于中度多態(tài)(0.25

表2 中國荷斯坦牛CSN3基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotypes and allele frequencies among four SNP loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

表3 中國荷斯坦牛CSN3基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters among four SNP loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

2.3 CSN3基因SNP位點(diǎn)的不同基因型對中國荷斯坦牛泌乳性狀的影響

將565頭荷斯坦母牛的3個(gè)泌乳性狀分別與CSN3基因突變位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果(表4)顯示，g.463A>G位點(diǎn)上的GG基因型泌乳性狀表現(xiàn)最優(yōu)，乳脂率極顯著高于AA基因型(P<0.01)，乳蛋白率顯著高于AA基因型(P<0.05)；g.1012A>C位點(diǎn)上的AA基因型為優(yōu)良基因型，其乳脂率極顯著高于CC基因型(P<0.01)；g.2015T>A位點(diǎn)不同基因型在乳脂率和乳蛋白率方面差異顯著(P<0.01)，TT基因型極顯著高于AT和AA基因型。g.2396A>T位點(diǎn)3種基因型各泌乳性狀指標(biāo)無顯著差異。

表4 中國荷斯坦牛CSN3基因的基因型與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性分析Table 4 Association of CSN3 gene polymorphisms with milk production traits of Chinese Holstein cattle

注：同一位點(diǎn)同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05) and different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.4 CSN3基因SNP位點(diǎn)的單倍型和連鎖不平衡分析

對CSN3基因上4個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析，總共檢測到16種單倍型，分別為Hap1～Hap16(表5)，其中單倍型Hap13的發(fā)生頻率最高，達(dá)到0.327，其次為單倍型Hap14和單倍型Hap9，發(fā)生頻率分別為0.161和0.083。由于發(fā)生頻率低于0.050的單倍型在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中沒有意義，故只保留Hap5、Hap7、Hap9、Hap13、Hap14和Hap15等6種用于雙倍型的關(guān)聯(lián)性分析。

連鎖不平衡分析結(jié)果(表6)表明，4個(gè)SNPs位點(diǎn)兩兩間的r2值均小于0.330。r2值大于0.330，表明2個(gè)位點(diǎn)間具有較強(qiáng)的連鎖不平衡，因此本研究發(fā)現(xiàn)的4個(gè)SNPs位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖性。

表5 中國荷斯坦牛CSN3基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)的單倍型頻率分析Table 5 Haplotypic frequencies among four SNPs loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

表6 中國荷斯坦牛CSN3基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析Table 6 Estimated LD values of four SNPs loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

2.5 CSN3基因SNP位點(diǎn)雙倍型對中國荷斯坦牛泌乳性狀的影響

經(jīng)分析得出，CSN3基因4個(gè)SNPs位點(diǎn)共有15種雙倍型，將其中發(fā)生頻率高于5.00%的雙倍型與中國荷斯坦牛泌乳性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果如表7所示。由表7可以看出，雙倍型H14H14個(gè)體的乳脂率極顯著高于雙倍型H13H14(P<0.01)，并且顯著高于雙倍型H5H15、H9H13和H13H13(P<0.05)。因此，在本試驗(yàn)群體中，雙倍型H14H14是最優(yōu)秀的雙倍型。

表7 中國荷斯坦牛CSN3基因雙倍型與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性分析Table 7 Diplotypes of CSN3 gene associated with milk production traits of Chinese Holstein cattle

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05) and different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01).

3 討 論

CSN3基因編碼的κ酪蛋白是哺乳動物乳蛋白的主要成分之一，其除起到營養(yǎng)作用外，還有一個(gè)重要的功能就是穩(wěn)定蛋白質(zhì)，防止牛奶蛋白質(zhì)凝聚和沉淀[9]，在自然狀態(tài)下，使牛奶保持穩(wěn)定的乳濁液狀態(tài)[10]。酪蛋白參與調(diào)控酪蛋白微團(tuán)的穩(wěn)定性，影響乳微粒的大小，進(jìn)而對乳品質(zhì)具有重要的調(diào)控作用[11]。酪蛋白含有動物體幾乎全部的必需氨基酸，是營養(yǎng)價(jià)值很高的蛋白質(zhì)，并且能提高幼仔對鈣、磷等的吸收能力[12]?；诖耍珻SN3基因可被視為對哺乳動物泌乳性能具有重要作用的候選基因。李玲等[13]發(fā)現(xiàn)，在3組泌乳性能不同的西農(nóng)薩能奶山羊中，CSN3基因在乳腺中的表達(dá)量對乳蛋白和產(chǎn)奶量具有顯著影響。趙春江等[14]通過酶切分型法分析了187頭中國荷斯坦牛CSN3基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)CSN3的突變位點(diǎn)與乳蛋白率顯著相關(guān)。Alim等[15]通過飛行質(zhì)譜法，在荷斯坦牛CSN3基因中檢測到6個(gè)SNP位點(diǎn)，這6個(gè)SNP位點(diǎn)均對產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率有影響。本研究發(fā)現(xiàn)了4個(gè)SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與Alim所檢測到的SNP位點(diǎn)不一致，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是樣本選擇以及樣本量不相同造成的。Alim采集樣本的地點(diǎn)在山東，樣本數(shù)量為398頭，而本試驗(yàn)的采樣地點(diǎn)在陜西，樣本數(shù)量為565頭。分析表明，本試驗(yàn)檢測出的CSN3基因的SNP位點(diǎn)與中國荷斯坦牛泌乳性狀緊密關(guān)聯(lián)。Caravaca等[16]就CSN3基因的多態(tài)性與產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，證實(shí)CSN3基因BB型具有較高的產(chǎn)奶量和乳蛋白率。在捷克弗萊維赫牛中，Matějicek等[17]通過組合CSN3和LGB基因的SNP位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，組合基因型ABAA與泌乳性能緊密關(guān)聯(lián)。Moioli等[18]在綿羊和山羊奶品質(zhì)的研究中對CSN3的多態(tài)性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CSN3基因?qū)θ榈鞍缀坑酗@著影響。Alipanah等[19]在俄羅斯牛種中發(fā)現(xiàn)，BB型個(gè)體比AA型和AB型有更高的乳蛋白率。有人通過篩選候選基因的方法，對CSN3基因外顯子啟動子區(qū)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與產(chǎn)奶性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[20-21]。奶牛的乳脂率一般為3.5%左右，而本研究的乳脂率都在4%以上，平均值為4.345%。這是由于牛奶中乳脂率受到諸多因素影響，包括奶牛品種、營養(yǎng)攝入、管理水平及泌乳階段等。本試驗(yàn)采樣過程中，所涉及到的奶?；咎幱诋a(chǎn)后的第4～8周，這一階段由于能量供給不足導(dǎo)致奶牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，奶牛會動用脂肪組織來供給能量，從而導(dǎo)致乳脂率較高。本試驗(yàn)在中國荷斯坦牛CSN3基因上檢測到4個(gè)SNP位點(diǎn)，除g.2396A>T位點(diǎn)外，其余3個(gè)SNP位點(diǎn)與泌乳性狀緊密關(guān)聯(lián),具體而言，g.463A>G和g.2015T>A均可以顯著影響乳脂率和乳蛋白率，g.1012A>C可以顯著影響乳脂率。雙倍型關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，H14H14乳脂率顯著高于其余雙倍型。綜上，CSN3基因可以作為候選基因應(yīng)用于中國荷斯坦牛泌乳性狀的選育工作中。

目前，越來越多的研究指出，3′UTR區(qū)域上的突變位點(diǎn)可以通過改變mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響到蛋白的表達(dá)和表型[22]。在中國荷斯坦牛上，F(xiàn)ADS2基因3′UTR區(qū)域上的c.1571A>G和c.2776A>G能夠顯著影響牛乳脂肪酸組成[23]；在秦川牛上，SIRT2基因的3′UTR區(qū)域的g.19676G>A突變與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)[24]；在南陽牛上，LHX4基因3′UTR區(qū)域的g.463A>G位點(diǎn)與牛的生長發(fā)育密切關(guān)聯(lián)[25]。本試驗(yàn)在中國荷斯坦牛CSN3基因外顯子和3′UTR區(qū)域共檢測到4個(gè)SNP位點(diǎn)(g.463A>G，g.1012A>C，g.2015T>A和g.2396A>T)，除g.463A>G外，其余3個(gè)SNP位點(diǎn)均定位于3′UTR區(qū)域，且不改變氨基酸結(jié)構(gòu)，但關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，g.1012A>C和g.2015T>A與中國荷斯坦牛泌乳性狀密切關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)中，g.1012A>C和g.2015T>A 2個(gè)SNP位點(diǎn)影響中國荷斯坦牛泌乳性狀的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，CSN3基因在中國荷斯坦牛中存在多態(tài)性，其中g(shù).463A>G、g.1012A>C和g.2015T>A與泌乳性狀緊密關(guān)聯(lián)，優(yōu)勢雙倍型為H14H14，其個(gè)體的乳脂率顯著或極顯著高于其他雙倍型，可以嘗試將CSN3基因作為影響泌乳性狀的候選基因用于標(biāo)記輔助選擇。

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