秦川肉牛FABP3及FABP4基因SNP與肉質性狀的關聯(lián)性

余橫偉，桂林生，胡 言，昝林森,2,3(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌7200；2國家肉牛改良中心，陜西 楊凌7200；3陜西省肉牛工程技術研究中心，陜西 楊凌 7200)

脂肪酸結合蛋白3(Fat acid binding proteins 3，F(xiàn)ABP3)又稱為心臟型脂肪酸結合蛋白(H-FABP)[1]，可與血漿長鏈脂肪酸( Long-chain fatty acid，LCFA)結合。作為機體主要的能量來源， LCFA維持著心臟的正常功能，敲除小鼠的FABP3基因，會導致其 LCFA代謝過程發(fā)生紊亂[2]。在大鼠實驗模型中發(fā)現(xiàn)，血清FABP3的水平與大鼠遭電擊后的血壓顯著相關[3]。此外，在小鼠的心臟舒張過程中，F(xiàn)ABP3基因的缺失能夠明顯抑制心臟對棕櫚酸的吸收和氧化，而心肌細胞對葡萄糖的吸收和利用卻提高了80%[4]，這說明FABP3基因在維持機體內脂肪酸代謝的動態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要的調控作用。

脂肪酸結合蛋白4(FABP4)，又被稱為A-FABP，同F(xiàn)ABP3一樣，也是FABPs家族的重要成員之一，其能夠在各種細胞區(qū)室如過氧化物酶體、線粒體、內質網、脂質液滴、核內[5-6]結合脂肪酸和相關化合物。FABP4基因最早由Spiegelman等于1983年在脂肪細胞中檢測到，與脂肪酸具有高度親和性，參與LCFA的合成代謝[7]。FABP4基因在脂肪細胞中的表達受脂肪酸和胰島素水平的調控[8]。以肥胖小鼠為模型，敲除FABP4基因能導致其胰島素和血漿葡萄糖水平顯著下降，且胰島素抗性增強[9]。FABP4是肥胖相關代謝綜合征的關鍵介質，研究表明該蛋白在2型糖尿病患者體內的表達水平顯著高于正常人，導致患者血漿甘油三酯和膽固醇的水平降低，這說明胰腺β細胞受到保護，機體的脂質代謝被改善[10-11]。在3T3-L1細胞中發(fā)現(xiàn)，過表達FABP4基因可增強線粒體功能，進而促進脂肪細胞分化和脂質沉積，干擾FABP4基因則表現(xiàn)出相反的效果[12]。

鑒于FABP3和FABP4基因在機體脂質代謝過程中所發(fā)揮的關鍵作用，筆者推測其可以作為候選基因，用于畜禽肉用性狀的選育研究中。因此，本研究以FABP3和FABP4為目標基因，檢測其單核苷酸多態(tài)性(SNP)，分析不同基因型及單倍型組合對秦川牛肉用新品系(以下簡稱“秦川肉?！?肉用性狀的影響，以期為秦川肉牛分子育種提供新的理論方法和技術途徑。

1 材料與方法

1.1 血樣的采集及DNA的提取

在西北農林科技大學國家肉牛改良中心和陜西省秦川肉牛良繁中心，隨機選擇18～24月齡健康的秦川肉牛571頭，尾靜脈采血10 mL/頭，樣品采集完畢后置于-80 ℃ 保存。使用TIANamp Blood DNA kit試劑盒(北京，天根)提取血樣DNA，DNA質量和濃度分別采用0.5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計進行檢測。

1.2 FABP3和FABP4基因的PCR擴增

根據GenBank公布的牛FABP3基因序列(基因組DNA登錄號為：AC_000159.1，mRNA登錄號為：NM_174313.2)和FABP4的基因序列(基因組DNA登錄號為：AC_000171.1，mRNA登錄號為：NM_174314.2),利用Primer 5.0軟件設計引物(表1)，交由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系為30.0 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix 15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上游、下游引物(10 pmol/μL)各0.6 μL，模板DNA(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 秦川肉牛FABP3和FABP4基因引物序列信息Table 1 Sequence information of primers of FABP3 and FABP4 genes in Qinchuan beef cattle

1.3 SNP位點的檢測

將擴增的PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行純化并測序，測序結果使用DNAMAN軟件進行對比分析，尋找SNP位點。

1.4 秦川肉牛肉用性狀指標的測定

肉用性狀包括背膘厚(BF)、眼肌面積(ULA)和肌內脂肪(IMF)含量 3個指標，按照桂林生等[13]的檢測方法進行測定。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

根據基因型統(tǒng)計結果，計算基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、遺傳雜合度(He)和有效等位基因數(Ne)，并進行Hardy-Weinberg平衡適應性檢驗(HWE)[14]。同時，使用HAPLOVIEW3.32軟件對FABP4基因的SNP位點進行連鎖不平衡分析及單倍型分析。采用SPSS13.0軟件中的GLM模型，分別對FABP3和FABP4基因突變位點的基因型與秦川肉牛肉用性狀(背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量)進行相關性分析，采用鄧肯法 (Duncan’s) 進行均數間的多重比較。結果用“平均數±標準誤”表示，以P<0.05 為差異顯著水平進行差異顯著性分析。GLM模型如下：Yijk=u+Gi+Aj+Eijk，其中Yijk為個體表型值，u為群體均值，Gi為標記基因型效應，Aj為年齡效應，Eijk為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 FABP3和FABP4基因PCR產物檢測

圖1、2和3為本試驗3對引物的PCR擴增結果，目的片段的長度分別為505，491和521 bp。結果顯示，擴增產物電泳條帶清晰，特異性較好，可以用作后續(xù)測序分析。

M.DNA Marker;1～5.PCR產物M.DNA Marker;1-5.PCR product圖1 秦川肉牛FABP3基因部分第3內含子和部分3′非翻譯區(qū)的PCR擴增Fig.1 Part of intron 3 and part of 3′UTR region individuals of FABP3 in Qinchuan beef cattle

M.DNA Marker;1～6.PCR產物M.DNA Marker;1-6.PCR product圖2 秦川肉牛FABP4基因部分第1內含子和第2外顯子的PCR擴增Fig.2 Part of intron 1 and exon 2 of FABP4 gene in Qinchuan beef cattleM.DNA Marker;1～5.PCR產物M.DNA Marker;1-5.PCR product圖3 秦川肉牛FABP4基因部分第3內含子、第4外顯子和部分3′非翻譯區(qū)的PCR擴增Fig.3 Part of intron 3,exon 4 and part of 3′UTR region of FABP4 gene in Qinchuan beef cattle

2.2 FABP3和FABP4基因的SNP位點分析

牛FABP3基因位于第2號染色體上，基因全長60 606 bp，含4個外顯子。本研究在FABP3基因第3內含子上檢測出1個SNP，即g.60298C>T(圖4)。牛FABP4基因位于第14號染色體上，基因全長4 389 bp，同樣含4個外顯子。本試驗在FABP4基因第1內含子上檢測到2個SNP，分別是g.2686A>T(圖5)和g.2834C>G(圖6)；在第4外顯子上檢測出1個SNP，即g.4220A>G(圖7)。在檢測到的4個SNP中，g.2686A>T只有2種基因型，分別是AA和AT基因型，TT基因型缺失,其他3個位點均有3種基因型。

圖4 秦川肉牛FABP3基因的SNP位點g.60298C>TFig.4 SNP (g.60298C>T) of FABP3 gene in Qinchuan beef圖5 秦川肉牛FABP4基因的SNP位點g.2686A>TFig.5 SNP (g.2686A>T) of FABP4 gene in Qinchuan beef

圖6 秦川肉牛FABP4基因的SNP位點g.2834C>GFig.6 SNP(g.2834C>G) of FABP4 gene in Qinchuan beef cattle圖7 秦川肉牛FABP4基因的SNP位點g.4220A>GFig.7 SNP(g.4220A>G) of FABP4 gene in Qinchuan beef cattle

表2 秦川肉牛FABP3和FABP4基因SNP位點的基因型和等位基因分布頻率Table 2 Genotype and allele frequencies of FABP3 and FABP4 genes for SNPs in Qinchuan beef cattle

表3 秦川肉牛FABP3和FABP4基因4個SNPs的遺傳參數Table 3 Genetic parameters among four SNPs loci within FABP3 and FABP4 genes in Qinchuan beef cattle

2.3 FABP3和FABP4基因SNP位點基因型對秦川肉牛肉用性狀的影響

將秦川肉牛的3個肉用性狀分別與FABP3基因突變位點的基因型進行關聯(lián)分析。結果(表4)顯示，g.60298C>T位點不同基因型個體的背膘和眼肌面積無顯著差異，肌內脂肪含量差異顯著(P<0.05)，其中TT基因型個體顯著高于CT和CC基因型個體。對FABP4基因而言，g.2834C>G位點上的CC基因型個體肉用性狀較優(yōu)，其眼肌面積極顯著高于GG和CG基因型個體(P<0.01)，肌內脂肪含量顯著高于GG和CG基因型個體(P<0.05)；g.4220A>G位點上的TT為優(yōu)良基因型，其背膘厚顯著高于CC和CT基因型(P<0.05)。

表4 FABP3和FABP4基因的SNP位點對秦川肉牛肉質性狀的影響Table 4 Effects of SNPs of FABP3 and FABP4 genes on meat quality traits in Qinchuan beef cattle

注：同列數據后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，標相同字母或未標字母者表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Notes:Different lowercase letter indicate significant difference (P<0.05),different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01),while same letters or no letter mean insignificant difference (P>0.05).The following below.

2.4 FABP4基因SNP位點的單倍型和連鎖不平衡分析

通過HAPLOVIEW 3.32軟件對FABP4基因上的3個SNP位點進行單倍型分析，總共檢測到8種單倍型，分別為Hap1～Hap8(表5)。表5顯示，單倍型Hap3的發(fā)生頻率最高，為0.428;其次為單倍型Hap1和Hap4，發(fā)生頻率分別為0.233和0.140。由于發(fā)生頻率低于0.050的單倍型在統(tǒng)計學分析中沒有意義，故刪除單倍型Hap5、Hap6和Hap8，保留其他單倍型用于后續(xù)分析。

表5 秦川肉牛FABP4基因單倍型分析Table 5 Haplotypes of FABP4 genes and their frequencies in Qinchuan beef cattle

對FABP4基因中的g.2686A>T、g.2834C>G、g.4220A>G 3個SNP位點兩兩進行連鎖不平衡分析,結果r2值均小于0.330(表6)?；趓2值大于0.330，表明2個SNP位點間具有較強的連鎖不平衡效應的原則[15]，可知以上3個SNP位點間不存在強的連鎖性。

2.5 FABP4基因SNP位點單倍型組合對秦川肉牛肉用性狀的影響

經分析得出，F(xiàn)ABP4基因中3個SNP位點共有19種單倍型組合，將發(fā)生頻率低于5.00%的不具有統(tǒng)計分析意義的12種單倍型組合刪除，對剩余的7個單倍型組合進行關聯(lián)性分析，結果見表7。由表7可知，7種單倍型組合背膘厚無顯著差異；單倍型組合H1H1個體的眼肌面積極顯著高于單倍型組合H3H3個體(P<0.01)，并且顯著高于單倍型組合H1H3、H1H4、H1H7和H3H4個體(P<0.05)；肌內脂肪含量方面，單倍型組合H1H1個體極顯著高于單倍型組合H3H7(P<0.01)。因此，在本試驗群體中，H1H1可被視為一種最為優(yōu)秀的單倍型組合。

表6 秦川肉牛FABP4基因SNP位點的連鎖不平衡分析r2值Table 6 Estimated values of LD for SNPs of FABP4 gene in Qinchuan beef cattle

表7 FABP4基因單倍型組合對秦川肉牛肉質性狀的影響Table 7 Effects of Diplotype of FABP4 genes on meat quality traits in Qinchuan beef cattle

3 討 論

FABP3基因在動物的心臟、骨骼肌和乳腺組織中呈現(xiàn)高水平表達，參與脂肪酸的轉運，促進脂肪酸的合成，對脂肪沉積、轉運及基因的轉錄具有重要的調控作用[16]。在H-FABP基因中鑒定的新SNP位點與北京油雞的大腿和胸肌的IMF含量相關[17]。Cho等[18]克隆出豬FABP3基因的mRNA，并檢測出了6個SNP位點，通過關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，位于第2外顯子上編碼80號位氨基酸的G>A突變可顯著影響背膘厚。同樣以豬為研究對象，Li等[19]在FABP3基因的第2內含子上發(fā)現(xiàn)了4個SNP位點，其均與背最長肌的嫩度、含水量和風味密切相關。Blecha等[20]在肉牛FABP3基因中檢測出3個SNP位點，其中位點rs109315289顯著影響牛的眼肌面積。本試驗對秦川牛FABP3基因全長進行了多態(tài)性分析，結果在其第3內含子上發(fā)現(xiàn)1個SNP位點g.60298C>T，該位點不同基因型的肌內脂肪含量差異顯著(P<0.05)，基因型TT個體顯著高于基因型CT和CC。

作為膜周邊蛋白，F(xiàn)ABP4可與長鏈脂肪酸、脂肪氧化產物和環(huán)氧化酶等疏水性化合物相結合，參與其代謝及信號轉導過程，在調控糖脂代謝和胰島素分泌方面發(fā)揮著重要作用[21]。目前，在人和小鼠上對該蛋白研究得比較全面。Matsumotoa等[22]在FABP4基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了2個SNP位點，分別為g.-259A>G和g.-287A>G，這2個SNP位點均能影響轉錄因子的結合，進而影響日本和牛的大理石花紋。Gao等[23]在用PCR-SSCP研究白豬Junmu 1號的過程中發(fā)現(xiàn)，A-FABP位點3 481 bp的點突變對肌內脂肪(IMF)含量有顯著的影響。在3個中國山羊品種中，Xu等[24]通過SSCP技術，在FABP4基因第1內含子上檢測到1個SNP位點，該位點與山羊的肌內脂肪含量緊密相關。Oh等[25]在韓國牛FABP4基因外顯子上檢測到3個SNP位點，其均顯著影響牛肉脂肪酸組成。本試驗在秦川肉牛FABP4基因上檢測到g.2686A>T、g.2834C>G和g.4220A>G 3個SNP位點，除g.2686A>T外，其余2個SNP位點與秦川肉牛肉用性狀緊密關聯(lián)，其中g.2834C>G可以顯著影響眼肌面積和肌內脂肪含量，g.4220A>G則可以顯著影響背膘厚。單倍型組合關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，單倍型組合H1H1個體眼肌面積和肌內脂肪含量顯著高于其余單倍型組合。

值得注意的是，本試驗檢測出的可顯著影響秦川肉牛肉用性狀的3個SNP位點(g.60298C>T、 g.2686A>T和g.2834C>G)中，g.60298C>T和g.2834C>G分別定位于FABP3和FABP4基因的內含子上，且為同義突變。這2個位點影響肉用性狀的機制可能是：內含子SNP位點可能與同一染色體上其他基因上存在的SNP位點呈現(xiàn)完全連鎖狀態(tài)[26]；內含子SNP位點可能影響剪接供體位點或其附近區(qū)域[27]，導致翻譯過程發(fā)生改變。

4 結 論

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因g.60298C>T和FABP4基因g.2834C>G、g.4220A>G在秦川肉牛中存在多態(tài)性，與肉用性狀緊密關聯(lián)。FABP4基因3個SNP位點的優(yōu)勢單倍型組合為H1H1(ACA-ACA)，其個體眼肌面積和肌間脂肪含量極顯著或顯著高于其他單倍型組合，故可將FABP3和FABP4基因作為影響肉用性狀的候選基因用于標記輔助選擇，以加速秦川肉牛定向高效選育和群體遺傳改良。

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