卵巢癌組織中miR-26b的表達(dá)變化及其意義

丁鑫，王乾印，馬亮亮

(青海紅十字醫(yī)院，西寧810000)

目前大部分卵巢癌患者被確診時(shí)已為晚期[1,2]，而如果在早期獲得治療，卵巢癌患者的5年生存率能夠提高到70%以上[3, 4]，因此早期診斷卵巢癌至關(guān)重要。目前，血清糖類抗原125(CA125)、人附睪蛋白4(HE4)檢測(cè)和盆腔檢查、影像學(xué)檢查等手段仍然是臨床上診斷卵巢癌的主要方法。然而這些檢查方法各有其局限性。miR-26是近來(lái)處于研究熱點(diǎn)的一類可能具有抑癌基因樣作用的miRNA家族。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-26b能夠在多種腫瘤中起抑癌基因樣作用，且與患者的臨床病理參數(shù)、預(yù)后有一定的關(guān)系，這些腫瘤包括宮頸癌[5]、骨肉瘤[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]等，但是上皮性卵巢癌組織中miR-26b表達(dá)變化及其臨床意義尚不明確。本研究觀察了卵巢癌組織 miR-26b表達(dá)變化，并探討其與卵巢癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，以期為卵巢癌的診斷、病情判斷、預(yù)后評(píng)估提供一個(gè)新的標(biāo)志物?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年6月～2013年10月收治的93例卵巢癌患者為觀察組。所有病例均為初診卵巢癌患者，術(shù)后病理檢查均確診為上皮性卵巢癌；患者手術(shù)之前均未接受放、化療等其他手段治療；已剔除年齡大于75周歲、術(shù)前接受其他治療手段、合并其他腫瘤、未能通過(guò)病理檢查確診的患者，并且去除術(shù)后5年內(nèi)失訪的患者。入組患者年齡39～71歲(50.73±6.12)歲，病理類型為子宮內(nèi)膜樣卵巢癌24例、黏液性卵巢癌11例、漿液性卵巢癌58例，腹水量≤300 mL者38例、>300 mL者55例，腹水細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果陰性41例、陽(yáng)性52例，F(xiàn)IGO分期Ⅰ～Ⅱ期34例、Ⅲ～Ⅳ期59例，組織分化程度高13例、中32例、低48例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移31例。。另取30例子宮肌瘤患者為對(duì)照組，患者年齡38～69(53.02±4.19)歲。收集觀察組患者手術(shù)切除卵巢癌組織標(biāo)本和對(duì)照組患者正常卵巢組織標(biāo)本用于實(shí)驗(yàn)。所有組織收集后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究已?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 miR-26b檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。嚴(yán)格按照TRIzol RNA分離提取試劑盒使用說(shuō)明操作，分離提取RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其純度，取OD260/OD280值控制在在1.8～2.0的樣本，按Prime ScriptTm反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明，直接將RNA直接逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后將合成的cDNA樣品稀釋后置于冰箱內(nèi)保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以U6 snRNA為內(nèi)參，miR-26b上游引物為5′-CAAAGGTCCATAGCAAGGGT-3′，下游引物為5′-GCGACCTTGTCATGGTTTATAG-3′；內(nèi)參照U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。先于95 ℃下預(yù)變性5 min，然后90 ℃持續(xù)15 s使之變性，60 ℃條件下持續(xù)30 s進(jìn)行退火及延伸，以上循環(huán)重復(fù)40次。以2-ΔΔCt表示miR-26b相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析 將觀察組按卵巢癌患者年齡、病理類型、腹水量、腹水細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果、FIGO分期、組織分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況分為相應(yīng)亞組，比較各亞組miR-26b相對(duì)表達(dá)量。

1.4 卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系分析 從接受卵巢癌手術(shù)治療的患者中初步篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的病例，以術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，征得患者與其家屬同意后，每個(gè)月采用電話或電子通訊等手段隨訪調(diào)查，隨訪時(shí)間段為2011年6月～2017年1月，隨訪時(shí)長(zhǎng)39～67(58±3.24)個(gè)月，剔除失訪樣本。以miR-26b相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為界，將患者分成miR-26b高表達(dá)(miR-26b相對(duì)表達(dá)量≥均數(shù))和miR-26b低表達(dá)(miR-26b相對(duì)表達(dá)量<均數(shù))者，按Kaplan-Meier法制二者生存曲線，用Log-Rank法比較二者5年生存率和生存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-26b相對(duì)表達(dá)量比較 觀察組、對(duì)照組miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.34±0.12、1.13±0.11，兩組miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05。

2.2 觀察組卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 觀察組年齡≤45歲、>45歲者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.35±0.09、0.31±0.11，二者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P>0.05；病理類型為子宮內(nèi)膜樣卵巢癌、黏液性卵巢癌、漿液性卵巢癌者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.09、0.30±0.07、0.33±0.12，三者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P>0.05；腹水量≤300 mL、>300 mL者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.17±0.13、0.45±0.22，二者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05；腹水細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果陰性、陽(yáng)性者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.09、0.47±0.12，二者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05；FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.43±0.11、0.29±0.10，二者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05；組織分化程度高、中、低者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.55±0.12、0.41±0.09、0.24±0.10，三者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05；有、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量分別為0.25±0.09、0.38±0.15，二者卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量相比，P<0.05。

2.3 卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量與患者預(yù)后的關(guān)系 miR-26b高、低表達(dá)者5年生存率分別為77.78%(35/45)、54.16%(26/48)，二者5年生存率相比，P<0.05。miR-26b高、低表達(dá)者生存時(shí)間分別為(54.09±2.00)、(44.54±2.78)個(gè)月，二者生存時(shí)間相比，P<0.05。

3 討論

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，以其較高的發(fā)病率、最高的致死率嚴(yán)重威脅著全世界范圍內(nèi)婦女的生存與生活質(zhì)量[6]。迄今尚未發(fā)現(xiàn)卵巢癌的特異性明確誘因，加上卵巢癌發(fā)病初期癥狀隱匿，因此無(wú)法早期應(yīng)用影像學(xué)檢查，而目前尚缺乏靈敏又方便的早期篩查方法，致使大部分獲得確切診斷的卵巢癌已經(jīng)是晚期[7]。這是卵巢癌病死率高的重要原因。如果卵巢癌能夠得到早期確診與積極治療，其生存率能夠從30%～50%提高到70%以上[8]，甚至于復(fù)發(fā)后依然能夠生存超過(guò)5年[9]。在卵巢癌早期診斷中，以miRNA為代表的腫瘤生物標(biāo)記物日益受到各方關(guān)注[10, 11]。miRNA是一類非編碼RNA，長(zhǎng)度僅約22個(gè)核苷酸，卻因其能夠與編碼基因mRNA的3′ 非編碼區(qū)(3′ UTR區(qū))結(jié)合，降解或抑制其翻譯，而在機(jī)體基因的內(nèi)源性調(diào)控中占據(jù)著重要的地位[12]。miRNA已被證實(shí)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的分化[13]、惡性進(jìn)展[14]和代謝[15]等方面起著重要的作用，且不同的miRNA在不同的腫瘤中所起的作用也不盡相同，有時(shí)同時(shí)具有抑癌與促癌基因樣作用[16]。因而各種miRNA在不同腫瘤中的作用需要分開探討。

miR-26是近來(lái)處于研究熱點(diǎn)的一類可能具有抑癌基因樣作用的miRNA家族。通過(guò)直接調(diào)節(jié)生促紅素人肝細(xì)胞A2(EphA2)，miR-26b能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)與遷移[17]。而在針對(duì)肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞系的研究中，miR-26b不僅直接調(diào)節(jié)EphA2，同時(shí)也能夠調(diào)低c-Myc癌基因與G1/S-特異性周期蛋白-D1(Cyclin D1)的表達(dá)，從而抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。此外，陸續(xù)有研究證實(shí)miR-26b能夠在多種腫瘤中起抑癌基因樣作用，且與患者的臨床病理參數(shù)、預(yù)后有一定的相關(guān)性[18]。

本研究結(jié)果顯示，miR-26b在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常的卵巢組織。提示卵巢癌組織中miR-26b表達(dá)降低，miR-26b在卵巢癌中也發(fā)揮抑癌基因樣作用，進(jìn)一步證明miR-26b在不同腫瘤組織中均能表現(xiàn)出抑癌基因樣作用。卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量雖然與患者的年齡和臨床病理類型無(wú)關(guān)，但與患者的腹水量、腹水細(xì)胞學(xué)陰陽(yáng)性、FIGO分期、癌組織分化程度、是否發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)均相關(guān)，提示miR-26b的表達(dá)水平很可能與卵巢癌細(xì)胞的分化、增殖與遷移能力相關(guān)。這與之前所提前研究結(jié)論相近，提示我們檢測(cè)卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量有助于判斷患者病情、預(yù)測(cè)腹水和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，miR-26b高表達(dá)者的5年生存率高于miR-26b低表達(dá)者，生存時(shí)間也比miR-26b低表達(dá)者長(zhǎng)。表明miR-26b低高表達(dá)的卵巢癌患者病情較重，病情惡化較快，預(yù)后不佳。

綜上，卵巢癌組織中miR-26b低表達(dá)，且卵巢癌組織miR-26b相對(duì)表達(dá)量與卵巢癌患者病情、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。miR-26b有望成為新一代卵巢癌早期診斷、預(yù)后推斷的腫瘤標(biāo)志物。檢測(cè)卵巢癌組織miR-26b有助于患者的病情判斷和預(yù)后評(píng)估。未來(lái)我們計(jì)劃將miR-26b與其他已知卵巢癌腫瘤標(biāo)記物、影像學(xué)手段相結(jié)合，探討更可靠、更靈敏、更易普及的卵巢癌早期診斷手段。

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