疲勞、饑餓輔助大腸桿菌上行感染法建立大鼠盆腔炎后遺癥模型

于瀟，劉鵬飛，劉金星，王麗，師偉，呂姝菡，丁怡，王憲，王玉超

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250000；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3濟(jì)南大學(xué))

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)盆腔炎后遺癥(SPID)進(jìn)行研究時(shí)，SPID動(dòng)物模型多采用開(kāi)腹手術(shù)法制備[1]，通過(guò)機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜并注入大腸桿菌的方法造模，與SPID臨床發(fā)病過(guò)程不符[2]。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)符合SPID臨床發(fā)病過(guò)程的SPID動(dòng)物模型構(gòu)建方法，探討行之有效的SPID動(dòng)物模型造模方法非常有必要。SPID臨床發(fā)病過(guò)程中病原菌是經(jīng)陰道上行感染。疲勞、饑餓可以降低免疫力，促進(jìn)炎癥進(jìn)程。2015年1月～2016年2月，我們用運(yùn)動(dòng)性疲勞、饑餓輔助大腸桿菌上行感染的方法制備大鼠SPID模型，效果滿意?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 SPF級(jí)雌性已育Wistar大鼠32只，體質(zhì)量(220±20)g，鼠齡12 周，購(gòu)自山東濟(jì)南朋悅動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度為40%～60%。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(菌株號(hào)ATCC35218)由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院微生物室提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院微生物室提供；麻醉劑1%戊巴比妥鈉、無(wú)菌生理鹽水、10%中性甲醛由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科提供。Proline 微量移液器(蘇州BIOHIT公司)，NW10LVF 超純水系統(tǒng)(香港Heal Force公司)。

1.2 造模方法 常規(guī)飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始造模。大鼠持續(xù)進(jìn)行負(fù)重(5%體質(zhì)量)游泳，至大鼠出現(xiàn)身體下沉、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性明顯下降、水淹沒(méi)鼻尖至再次浮出水面時(shí)間超過(guò)10 s[3.4]，連續(xù)12天。然后暴露大鼠陰道，用一次性移液槍頭注入6×106/mL大腸桿菌懸液0.5 mL，待液體被陰道黏膜完全吸收后放回籠內(nèi)。1次/d，連續(xù)進(jìn)行10天。其間隔天投喂1次[5]。每日投喂量嚴(yán)格控制為大鼠體質(zhì)量的10%，飲水不受限制。

1.3 造模效果觀察方法 造模過(guò)程中觀察各組大鼠皮毛顏色、色澤、皮毛狀態(tài)、雙眼狀態(tài)、精神狀態(tài)、食量及肛周清潔度的變化。造模完成后用1%戊巴比妥鈉(劑量50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，牽拉大鼠四肢及頭部固定于操作臺(tái)上，剪去下腹部的皮毛，并用碘伏消毒。在無(wú)菌條件下，取下腹部正中切口長(zhǎng)約 1 cm，開(kāi)腹后暴露雙側(cè)子宮、輸卵管、卵巢及其周圍結(jié)締組織，肉眼觀察局部病理形態(tài)后摘取輸卵管、卵巢及部分外周結(jié)締組織，置于10%中性甲醛中保存。肉眼觀察輸卵管有無(wú)充血、增粗、阻塞、積水，輸卵管卵巢有無(wú)粘連、腫塊或囊腫形成，盆腔結(jié)締組織有無(wú)增生、粘連、滲出等情況。將各組大鼠輸卵管、卵巢和周圍結(jié)締組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，定性描述局部顯微結(jié)構(gòu)的改變情況。

2 結(jié)果

造模過(guò)程中可見(jiàn)大鼠皮毛粗糙、稀疏成縷，色黃，精神不振，雙眼黯淡無(wú)神，雙耳色黯，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，食欲下降，體質(zhì)量減輕，陰道分泌物增多，大便質(zhì)稀，有肛周污染。造模完成后取大鼠輸卵管、卵巢及周圍結(jié)締組織大體觀察，可見(jiàn)輸卵管顏色暗紅、迂曲質(zhì)硬，或有輸卵管積水，黏膜組織瘀點(diǎn)，盆腔內(nèi)有廣泛纖維組織粘連，部分可見(jiàn)透明樣卵巢囊腫。鏡下觀察大鼠輸卵管管腔有不同程度擴(kuò)張，黏膜層皺襞平坦，腔內(nèi)可見(jiàn)大量粉染液體，部分輸卵管壺腹部皺襞增生，融合；見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，伴周圍結(jié)締組織增生，細(xì)胞走行紊亂，腺體、間質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，部分腺體壞死，外周血管擴(kuò)張。

3 討論

SPID是盆腔炎未得到及時(shí)正確治療而發(fā)生的女性上生殖道及其周圍組織破壞、廣泛粘連、增生及瘢痕形成等一系列后遺癥，即既往稱謂的慢性盆腔炎[6]。因盆腔炎臨床癥狀輕重的異質(zhì)性較大，常就診不及時(shí)、治療不全面，易發(fā)展為SPID，由其導(dǎo)致的不孕占不孕患者的20%～30%，SPID患者異位妊娠率是正常女性8～10倍，約20%患者遺留慢性盆腔痛，且易反復(fù)發(fā)作[7，8]，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量。

目前國(guó)內(nèi)多采用開(kāi)腹手術(shù)法制備SPID動(dòng)物模型，即經(jīng)“腹壁-子宮壁-子宮-輸卵管”的途徑注入菌液，并配合機(jī)械輕微損傷宮腔組織[1]，明顯與SPID臨床發(fā)病過(guò)程不符。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)符合臨床發(fā)病過(guò)程的明確的SPID動(dòng)物模型，未明確區(qū)分盆腔炎與SPID，仍以盆腔炎模型代替SPID研究。模擬SPID臨床發(fā)病條件，建立相應(yīng)動(dòng)物模型，對(duì)研究SPID的發(fā)病機(jī)制和治療方法有重要意義。

造模動(dòng)物選擇的基本要求是選擇具有與人類相似的內(nèi)生殖器官結(jié)構(gòu)的哺乳動(dòng)物，家兔和大鼠是國(guó)內(nèi)外研究的主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1,9]。大鼠子宮在盆腔中占有很大的比例，病理現(xiàn)象觀察較為方便[1]。采用大鼠作為SPID造模動(dòng)物，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定和成本低廉等優(yōu)勢(shì)。感染源種類方面，國(guó)內(nèi)以內(nèi)源性混合病原體為主。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為SPID造模應(yīng)采取單一病原體，因其致病因素明確，能較好重現(xiàn)SPID的臨床病理過(guò)程[10]。陳磊等[11]報(bào)道SPID最常見(jiàn)的病原菌是大腸桿菌和表皮葡萄球菌。故本研究感染實(shí)驗(yàn)組選用的病原菌是大腸桿菌。

要制作符合臨床證候的SPID動(dòng)物模型，除陰道內(nèi)接種病原菌模擬陰道上行感染外，還需耗傷正氣，使其抗病祛邪能力低下而提高成模率。疲勞因素是常用的消耗正氣的造模方法，一般以無(wú)損傷的游泳運(yùn)動(dòng)方式為主[12]，表現(xiàn)為大鼠鼻孔沒(méi)入水面以下5～10 s不能主動(dòng)上浮、協(xié)調(diào)動(dòng)作消失，伴有食欲低下、反應(yīng)遲鈍、體毛蓬亂、精神倦乏等[3.4]。飲食不節(jié)因素也是比較常見(jiàn)的削奪正氣的致病因素。劉軍等[5]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用饑餓與復(fù)食相交替的間歇性饑餓法，可使大鼠發(fā)情周期停止，垂體功能受到抑制，內(nèi)分泌狀態(tài)紊亂。

本組大鼠造模后輸卵管、卵巢及周圍結(jié)締組織有明顯的盆腔炎性疾病后遺癥病理改變，提示造模成功。而且感染經(jīng)過(guò)符合人SPID臨床發(fā)病過(guò)程。本研究為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目項(xiàng)目“盆腔炎性疾病后遺癥大鼠非手術(shù)建模評(píng)價(jià)及證候?qū)傩缘难芯俊焙蜕綎|省自然科學(xué)基金“基于無(wú)創(chuàng)法建模和方證相應(yīng)理論的慢性盆腔炎大鼠模型評(píng)價(jià)的研究”的分支實(shí)驗(yàn)。本研究結(jié)果為下一步進(jìn)行SPID的相關(guān)動(dòng)物研究奠定了基礎(chǔ)。

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