耐紫杉醇宮頸癌細(xì)胞株Hela特異性結(jié)合多肽的篩選及其功能鑒定

李倩, 左璇，鄧成程, 尹東鋒

(1新疆軍區(qū)總醫(yī)院，烏魯木齊830000；2中國人民解放軍第11醫(yī)院)

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病數(shù)逐年增高且呈年輕化趨勢[1，2]?；熓菍m頸癌常用的治療方法，但近年來耐藥宮頸癌的出現(xiàn)導(dǎo)致化療效果差，腫瘤細(xì)胞的靶向治療為宮頸癌的臨床研究提供了一條新的思路。尋找高效、高特異性和靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞的治療藥物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3，4]。多肽是由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合而成的化合物，具有分子量小、特異性強(qiáng)、可降解及無免疫原性等特點(diǎn)。靶向多肽對于腫瘤細(xì)胞具有高度特異性和親和力。噬菌體展示是一種篩選多功能性多肽的生物技術(shù)，將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[5，6]。2016年8～2017年10月,我們通過噬菌體展示技術(shù)，從肽庫中篩選出與耐紫杉醇(PTX)的宮頸癌Hela細(xì)胞株(Hela/PTX)有高度親和力的多肽，并鑒定其與Hela/PTX細(xì)胞的結(jié)合力和特異性?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌Hela耐藥細(xì)胞株Hela/PTX由本實驗室構(gòu)建；骨肉瘤細(xì)胞株購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；噬菌體隨機(jī)七肽庫(肽庫)購自英國Biolabs公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；HRP標(biāo)記的抗M13噬菌體單克隆抗體購自美國Amersham公司；PEG8000及IPTG/X-gal均購自北京鼎國生物有限公司。

1.2 靶向多肽的篩選 采用競爭性結(jié)合實驗。將對數(shù)生長期的Hela及Hela/PTX細(xì)胞培養(yǎng)至鋪板板底，Hela細(xì)胞中加入1 mL封閉液，37℃孵育1 h。加入10 μL的肽庫原液，搖動1 h。將孵育過Hela的噬菌體混合液轉(zhuǎn)移至耐藥細(xì)胞Hela/PTX板，搖動1 h。PBS沖洗后，加入1 mg/mL BSA分離已結(jié)合的分子，搖動10 min，收集洗脫液，加入150 μL 1mol/L的Tris-HCl(pH值9.1)中和上述洗脫液，收集洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增。挑ER2738單克隆于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后將培養(yǎng)物1∶100稀釋于20 mL的LB中，加入上述洗脫物。37 ℃劇烈搖動4.5 h，離心后取上清液加入PEG/NaCl，讓噬菌體4 ℃沉淀過夜。沉淀物重懸于1 mL TBS中，離心后取上清加入PEG/NaCl再沉淀，冰上孵育60 min后離心10 min，取沉淀物重懸于200 μL TBS，0.02% NaN3離心1 min，上清轉(zhuǎn)入新鮮管中，此即為擴(kuò)增后的洗脫物。用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物，計數(shù)其中噬菌體陽性克隆數(shù)量，然后4 ℃貯存[7]。共進(jìn)行3次篩選。

將3輪篩選后獲得的洗脫物送蘇州金唯智生物科技有限公司，用ELISA法檢測洗脫物中多肽與Hela/PTX細(xì)胞親和力(以P/N表示)，選取P/N值最大的10條多肽進(jìn)行測序，命名其中P/N值最大的一條多肽，將其序列交上海吉爾多肽公司合成。

1.3 所得靶向多肽的功能鑒定 采用質(zhì)譜法測量所得靶向多肽的分子量。用細(xì)胞親和力實驗觀察所得多肽與Hela/PTX細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。用0.25%胰酶消化Hela/PTX細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞，以4×105/孔的密度均勻接種在12孔板，孵育過夜，使細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%。換無血清的DMEM 培養(yǎng)基，用無血清的DMEM將靶向多肽稀釋至200 μg/mL，每孔加入0.5 mL稀釋好的多肽溶液，輕輕搖動12 孔板使多肽混合均勻，孵育2 h后PBS 沖洗2 遍，加入新鮮培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察[8]。

2 結(jié)果

經(jīng)過3輪競爭結(jié)合實驗最終獲得86 個克隆。ELISA結(jié)果顯示其中P/N值最大的一個P/N值為3.2，命名為EP-7，測序獲得其氨基酸序列為Glu-Arg-Thr-Ile-Ser-Leu-Pro(ERTISLP)。

質(zhì)譜分析顯示EP-7分子量為815.30 D。細(xì)胞親和力實驗結(jié)果顯示Hela/PTX 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有綠色熒光，而骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)未觀察到綠色熒光，表明多肽EP-7可以與Hela/PTX 細(xì)胞結(jié)合而不能與骨肉瘤細(xì)胞結(jié)合。

3 討論

宮頸癌是女性高發(fā)的惡性腫瘤之一，發(fā)病數(shù)逐年增高且呈年輕化趨勢[9～11]。化療是宮頸癌常用的治療方法，但近年來耐藥宮頸癌的出現(xiàn)及嚴(yán)重的毒副作用導(dǎo)致治療效果效果差。腫瘤細(xì)胞的靶向治療能夠選擇性作用于病變部位，控制藥物的分布與釋放，提高藥效和降低毒副作用，為宮頸癌的臨床研究提供了一條新的思路[12]。目前臨床研究顯示可以通過以下4種途徑實現(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動靶向性：①以抗體為靶標(biāo)的主動靶向系統(tǒng)[13]；②配體-受體主動靶向系統(tǒng)[14]；③多肽/蛋白質(zhì)配體修飾的主動靶向系統(tǒng)[15]；④維生素類如葉酸[16]等配體修飾的主動靶向系統(tǒng)。

多肽是由三個或三個以上氨基酸分子脫水縮合以肽鏈連接在一起而成的化合物，具有分子量小、特異性強(qiáng)、可降解及無免疫原性等特點(diǎn)[17]。探索能與Hela細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽分子作為蛋白標(biāo)簽對于研究宮頸癌的靶向治療方法具有重要意義。為了實現(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動靶向性，提高化療藥物在病灶的分布，本研究通過噬菌體展示技術(shù)篩選并合成出一種與Hela/PTX細(xì)胞膜表面分子結(jié)合的多肽。

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面[18 ]。我們以此原理為基礎(chǔ)，以Hela/PTX細(xì)胞為靶細(xì)胞，選用噬菌體隨機(jī)七肽庫進(jìn)行三輪篩選，從所得的噬菌體克隆中選擇挑選P/N值最大的10個進(jìn)行測序，并篩選出其中一條P/N值最高的多肽，命名為EP-7，其P/N值高達(dá)3.2，序列為Glu-Arg-Thr-Ile-Ser-Leu-Pro(ERTISLP)。該多肽與Hela/PTX細(xì)胞有高度特異性和親和力，以此多肽作為靶向頭基，能夠?qū)崿F(xiàn)遞藥系統(tǒng)的主動靶向性；且該多肽與腫瘤細(xì)胞結(jié)合可能會抑制細(xì)胞膜的某些功能，可能會抑制腫瘤細(xì)胞的生長或者與化療藥物有協(xié)同作用，具有治療效果，可用于腫瘤的靶向治療。抗腫瘤藥物及其遞藥系統(tǒng)經(jīng)過靶向多肽修飾，可增加藥物的腫瘤主動靶向性，達(dá)到更有效、精確和安全的治療，提高患者依從性[19]。然而，由于腫瘤細(xì)胞表面的生物活性分子非常復(fù)雜，導(dǎo)致噬菌體與細(xì)胞的非特異性結(jié)合較高，篩選的結(jié)果不是很理想[20]。靶向多肽在腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)中的研究還不夠成熟，還需要做大量的前期研究才能實現(xiàn)臨床應(yīng)用。相信隨著多肽及相關(guān)衍生物的大量出現(xiàn)和篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，可以得到與腫瘤細(xì)胞具有極高度特異性和親和力的靶向多肽，從而進(jìn)一步推進(jìn)多肽在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用。

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