基于Shotgun液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究膜蛋白組學(xué)的進展＊

孔德志，任雷鳴，張 煒

（河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 石家莊 050017）

隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的進步，用質(zhì)譜對復(fù)雜蛋白樣品進行檢測時，也用到了人類基因組研究項目中用到的“鳥槍法”（Shotgun）策略[1]。隨著電噴霧（ESI）高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的成熟，測定蛋白經(jīng)酶解后所形成多肽的質(zhì)荷比（質(zhì)量與電荷的比值，簡稱質(zhì)荷比，m/z）和經(jīng)質(zhì)譜碰撞所產(chǎn)生的離子碎片，利用蛋白序列數(shù)據(jù)庫的信息，計算機可以高通量快速地鑒定肽段并進行蛋白質(zhì)的組裝。與常規(guī)二維電泳（2-DE）相比，避免了對疏水性、低豐度、分子量極大極小蛋白的偏向性，短時間內(nèi)可以鑒定上千種蛋白質(zhì)。小于100個氨基酸的膜蛋白通常很難檢測，而應(yīng)用基于質(zhì)譜的方法可以鑒定到很多小分子膜蛋白[2]。另外，質(zhì)譜技術(shù)不僅能夠檢測蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列，還能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)被翻譯后序列的修飾情況[3]。但是，由于膜蛋白的疏水性、低豐度等特點，在進行Shotgun質(zhì)譜分析前仍需要對樣品進行一些特殊的處理，本文針對膜蛋白樣品的前處理及相關(guān)應(yīng)用研究的進展做一綜述。

1 膜蛋白的樣品前處理

與常規(guī)Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)相似，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定性定量膜蛋白時同樣需要提取蛋白并進行合適的酶切，以適應(yīng)質(zhì)譜的檢測。由于膜蛋白的特殊性，在膜蛋白的提取和酶切時應(yīng)該格外注意，對于膜蛋白樣品的前處理本文主要關(guān)注膜蛋白的富集和提取、酶切過程。至于膜蛋白提取后的還原烷基化過程一般與常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的處理相同：用DTT（二硫蘇糖醇）或TCEP[三(2-羧乙基)膦]進行二硫鍵的還原，再用IAM（碘乙酰胺）進行烷基化處理[4]；為降低樣品的復(fù)雜性，增加蛋白的鑒定數(shù)量，可以將富集后的膜蛋白進行預(yù)分離，如：依據(jù)等電點進行蛋白的預(yù)分離，也可以將酶切后的肽段利用高pH條件下的反相C18柱、或離子交換柱進行肽段的預(yù)分組；最后應(yīng)用納升液相（Nano LC）進行肽段的分離、高分辨質(zhì)譜檢測，最近有文獻指出鑒于儀器靈敏度的提升，用微升液相（Micro LC）也能達到滿意的蛋白定性效果，但是由于微升液相的穩(wěn)健性更適合于蛋白的定量[5]。

1.1 膜蛋白的富集與提取

膜蛋白樣品既可以是動植物或人體的不同組織，也可以是不同來源的培養(yǎng)細胞。但是，需要指出在體的細胞與培養(yǎng)的細胞在膜蛋白水平不能認為等同，二者存在差異[6]。不管是什么來源的樣品，在提取膜蛋白之前，均需要一些處理，包括組織研磨、超聲、低滲、反復(fù)凍融等手段以裂解細胞。

1.1.1 分離純化細胞膜

利用細胞膜的特性，先將細胞膜與其它細胞器分離，再提取膜蛋白是經(jīng)典的膜蛋白制備方法。離心制備的細胞膜粗提物，可進一步用傳統(tǒng)的密度梯度離心或兩相分離法純化細胞膜，但該過程不可避免的會受到胞質(zhì)蛋白的污染，故只能作為一種膜蛋白富集的手段[7]。Rui等介紹了一種用傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心和兩相聚合物分離純化肝細胞膜蛋白的詳細方法[8]。細胞膜在破碎后會形成大片狀、小囊泡的結(jié)構(gòu)，大片狀的細胞膜易于同細胞核或未破碎的細胞粘附在一起，若離心棄沉淀會造成膜蛋白的流失。用堿性溶液（如Na2CO3溶液）清洗細胞膜可以去掉其表面粘附的胞質(zhì)蛋白，細胞膜此時易形成小囊泡狀的膜結(jié)構(gòu)，可減少初步離心棄沉淀所造成的損失，此時堿溶液的量要大于細胞體積的50倍以上[9]。既然用溫和的方法破膜，有利于形成大片狀的細胞膜，有文獻報道用低滲溶液結(jié)合液氮凍融法破碎細胞膜、用低滲溶液多次離心清洗，棄去含有胞質(zhì)等污染成分的上清，制備了包括細胞膜、核膜和線粒體膜的膜組分，用該法制備膜蛋白的重復(fù)性非常好，4次平行試驗所提取的蛋白含量變異系數(shù)（CV）為7.7%，質(zhì)譜非標(biāo)定量（label-free quantification）法測定膜蛋白的含量，2次平行試驗中99%的蛋白其CV值不大于30%[10]。

利用細胞膜的負電性，采用陽離子納米顆粒包裹在細胞膜的表面，再用陰離子聚合物中和未與細胞膜結(jié)合的陽離子納米顆粒，以防止陽離子納米顆粒在細胞破碎后與其它膜組分結(jié)合。由于納米顆粒的結(jié)合，極大的增加了細胞膜的密度，使得細胞膜比其他任何亞細胞器的密度都大，這樣，細胞破碎后用較低的離心力離心，即可制備得到較為純凈的細胞膜，用這種方法也可以針對性的研究細胞的頂膜或基底膜。Choksawangkarn等考察了用3種不同密度的陽離子納米顆粒（Al2O3、用Al2O3包裹的Fe3O4、用Al2O3包裹的SiO2）分離膜的效果，經(jīng)過Shotgun質(zhì)譜技術(shù)鑒定所得到的膜蛋白，結(jié)果表明密度最大的Fe3O4顆粒分離效果最好；另外，不同納米顆粒具有不同的選擇性，Al2O3顆粒傾向于富集堿性膜蛋白，而Fe3O4顆粒更傾向于富集疏水性的膜蛋白[11]。

針對感興趣的膜蛋白，還可以用另一種策略，可把所關(guān)心的膜蛋白封裝到一種人造納米膜盤（nanodisc）中，然后用質(zhì)譜技術(shù)分析人造納米膜所封裝的蛋白。用磷脂和骨架蛋白等組裝材料形成nanodisc，依據(jù)組裝材料的種類和比例不同可以封裝不同的膜蛋白，且能保持蛋白的活性。文獻報道以磷脂和His標(biāo)記的MSP1E3D1骨架蛋白形成的nanodisc，封裝了哺乳動物細胞的膜蛋白，形成了細胞膜蛋白的功能納米膜盤庫（functional nanodisc library），經(jīng)過純化、拆卸nanodisc后，用質(zhì)譜進一步分析所封裝的膜蛋白。需要指出的是，在進行質(zhì)譜分析前須去除MSP1E3D1骨架蛋白，以防止其掩蓋待分析目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜信號[12]。

1.1.2 膜蛋白的抽提

由于膜蛋白的疏水性，為了增加膜蛋白的溶解，需要加入表面活性劑、有機溶劑、離液劑（chaotropes）等溶劑，如Sodium dodecyl sulfate（SDS）、NP-40、Tween-20、Triton X-100、sodiumdeoxycholate（SDC）、乙腈、尿素等，有文獻[13，14]對這些膜蛋白提取劑的應(yīng)用進行了綜述。最近，Zhang等同時應(yīng)用了兩種膜蛋白復(fù)合提取劑DDM/CHS（n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate）以提高膜蛋白的提取效率[15]。由于膜蛋白鑲嵌在細胞膜的磷脂雙分子層中，脫脂可以增加膜蛋白的提取率，但脫脂本身也會造成膜蛋白的損失。Raimondo等用14倍體積的冰冷tributyl phosphate（TBP）/acetone/methanol mixture（1∶12∶1）脫脂，優(yōu)化后的方法可以使膜蛋白的鑒定數(shù)目增加50%[16]。文獻[17]在分析McA-RH7777細胞膜蛋白時也用甲醇進行了脫脂處理。

盡管傳統(tǒng)的表面活性劑（如：SDS）在膜蛋白的提取中應(yīng)用非常廣泛，但是這些表面活性劑與質(zhì)譜的兼容性并不好，現(xiàn)在人們越來越關(guān)注研究新型質(zhì)譜兼容性的高效膜蛋白提取劑。Zhao等用質(zhì)譜兼容的離子液體 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride（C12Im-Cl）來提取膜蛋白，結(jié)果表明該離子液體比SDS、Rapigest、methanol提取后鑒定的膜蛋白數(shù)量要多，用該法研究大鼠腦組織的膜蛋白，所鑒定的內(nèi)在膜蛋白比用SDS多了1.4倍（251 vs 178）；且C12Im-Cl對胰蛋白酶的酶解活性無影響，更有利于疏水性肽段的溶解[18]。Amphipols（APols）是另一種質(zhì)譜兼容性的膜蛋白提取劑，亦不影響胰蛋白酶的活性，故酶解前無需去除，在質(zhì)譜分析前僅需要一步酸化和離心即可沉淀APols，Ning等[19]用APols建立了One-Step快速抽提膜蛋白的前處理方法，避免了傳統(tǒng)表面活性劑和離液劑的使用，減少了蛋白樣品的損失。

1.1.3 基于膜蛋白表面的特質(zhì)性進行膜蛋白的提取

膜蛋白氨基酸序列的糖基化修飾非常普遍，是膜蛋白實現(xiàn)功能的必要修飾?？梢砸罁?jù)膜蛋白上的糖基修飾[20,21]，特別是N-glycosylation進行膜蛋白的富集，一方面利用糖結(jié)構(gòu)中的醛基和酮基，硼酸可與鄰近的兩個羥基形成非可逆硼酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)；另一面可利用凝集素或標(biāo)記的凝集素與糖特異性的結(jié)合，凝集素的最大特點是可以識別糖蛋白和糖肽中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)（即細胞膜表面的碳水化合物決定簇）。另外，不同的凝集素對糖基的識別也具有一定的選擇性，如刀豆凝集素易與α-D-吡喃糖基結(jié)合，麥芽凝集素易與N-乙酰糖胺結(jié)合，菜豆凝集素易與N-乙酰乳糖胺結(jié)合，而且凝集素具有多價態(tài)結(jié)合的能力，可以進一步與生物素、酶、膠體金、鐵蛋白等結(jié)合，有利于下一步的分離與示蹤[22]。Strassberger等用生物素（EZ-link sulfo-NHS-LC-biotin）富集了髓性白血病細胞表面的320個膜蛋白，并針對發(fā)現(xiàn)的CD166/ALCAM蛋白設(shè)計了抗體，具有較好的腫瘤殺滅作用[23]。Soulet等用在體生物素結(jié)合非標(biāo)記蛋白定量的質(zhì)譜方法，首次研究了雞胚胎血管和基質(zhì)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)[24]。關(guān)于糖蛋白的分離純化策略可見文獻[25]，基于凝集素的糖蛋白富集可進一步參考相關(guān)綜述[26]，根據(jù)糖的性質(zhì)也可以使用其它策略，比如酶切后用二氧化鈦、HILIC材料富集糖肽[27]。

由于胞外區(qū)的蛋白序列具有信號傳遞、藥物結(jié)合、與宿主細胞結(jié)合的重要意義，故可以直接富集這些胞外區(qū)的蛋白序列[28]，忽略其跨膜區(qū)域的蛋白序列。除了用免疫親和的方法可以“剃去”（Shaving）細胞膜表面的蛋白，也可以用蛋白酶在細胞或細菌存活的狀態(tài)下“剃去”其表面的蛋白，鑒定這些胞外區(qū)的蛋白序列，該法尤其適合于致病微生物表面蛋白的研究[29]。

而一些市售的膜蛋白提取試劑盒（如Novagen TM-PEK，Sigma ProteoPrep?Membrane Extraction Kit，PIERCE Mem-PER?）一般利用膜蛋白的疏水特性進行膜蛋白的提取，具有方便迅速的特點，但干擾蛋白也較多。

1.2 膜蛋白的酶解

胰蛋白酶（trypsin）是蛋白質(zhì)組學(xué)中最常使用的消化酶，然而膜蛋白跨膜區(qū)域中可供trypsin酶切的位點（賴氨酸和精氨酸）較少，酶切后易產(chǎn)生許多疏水性的大片段，不易溶解且不利于質(zhì)譜檢測，從而降低了膜蛋白的序列覆蓋度。進一步提高酶解效率、增加膜蛋白序列的覆蓋度并減少酶切耗時是人們所關(guān)注的問題。

有人采用兩步酶解法，首先用胰酶（1∶20）37℃酶解3.5 h，高速離心后將沉淀進一步用糜蛋白酶和Trypsin過夜酶解，終止酶解后，將兩部分酶解后的肽段合并，以增加酶切位點，提高蛋白序列的覆蓋度[30]。將Trypsin固定到惰性顆粒表面，可以縮短酶解耗時，Chao等將Trypsin固定到疏水性聚合物和親水性聚合物的納米顆粒表面，用這種雙基質(zhì)固定的Trypsin酶解膜蛋白，不僅縮短了酶解時間，而且與溶液酶解相比，鑒定到的肽段數(shù)增加約2倍，提高了蛋白序列的覆蓋度[31]。雙酶酶解反應(yīng)器（bi-enzymatic reactor，糜蛋白酶和Trypsin均固定到硅膠納米顆粒）在大鼠肝臟膜蛋白的鑒定試驗中，雙酶反應(yīng)器比單獨用糜蛋白酶或Trypsin反應(yīng)器鑒定的膜蛋白數(shù)量多了1倍（單獨用糜蛋白酶反應(yīng)器鑒定出了1010個，單獨Trypsin反應(yīng)器鑒定出了1184個，而雙酶組合反應(yīng)器鑒定出了2891個膜蛋白），同時也增加了所鑒定蛋白的序列覆蓋度，酶解時間也縮短到了1 min以內(nèi)[32]。

由于膜蛋白的疏水性，在酶解過程中可能形成沉淀，在酶解過程中加入含1.0%脫氧膽汁酸鈉（SDC）的NH4HCO3溶液，雖然沒有增加膜蛋白的鑒定數(shù)目，但增加了多肽的匹配數(shù)目[33]。在FASP（Filter-aided sample preparation）法中，Andrew[34]等認為在含SDC的溶液中酶切，不能增加蛋白的鑒定數(shù)量，僅僅是對肽段有略微的選擇性差異，這與Erde[35]認為SDC可以增加蛋白序列的覆蓋度和蛋白定量的回收率不相一致。Metthew等考察了8種商品化質(zhì)譜兼容性的表面活性劑[Invitrosol、PPS Silent Surfactant、Progenta anionic acidlabile surfactant(AALS)I、Progenta AALS II、Progenta cationicacid labile surfactant(CALS)I、Progenta CALS II、ProteaseMax、RapiGest SF]、甲醇乙腈兩種有機溶劑、尿素和鹽酸胍兩種離液劑對膜蛋白的酶解效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨使用Progenta陰離子表面活性劑時酶解效果較好，但當(dāng)用乙腈（20%）、鹽酸胍（1 mol·L-1）和表面活性劑（0.1%）組成復(fù)合試劑時，可最大化的增加酶解的特異性（＞90%），增加肽段的鑒定數(shù)目，增加蛋白序列的平均覆蓋度以及蛋白跨膜區(qū)域的覆蓋度[36]。

另外由于膜蛋白表面的糖基化修飾，不利于酶切，也不利于質(zhì)譜在正離子模式下的檢測，因此在酶切前，可用糖基肽酶（PNGase F）等去除膜蛋白表面的糖基化修飾。Jedrychowski在用質(zhì)譜測定irisin時，用Deglycosylation Mix去除其糖基化修飾，以增加irisin酶切后肽段的定量效果[37]。

不同的酶切方式也影響著膜蛋白的鑒定，Waeowalee等比較了膠內(nèi)酶切、溶液酶切及FASP酶切對骨髓瘤細胞膜蛋白的鑒定情況，采用膠內(nèi)酶切可以鑒定出106個至少包含一個跨膜區(qū)域的膜蛋白，而溶液酶切僅能鑒定出33個膜蛋白，F(xiàn)ASP酶切僅能鑒定出37個膜蛋白，認為膠內(nèi)酶切的方式更適合膜蛋白的鑒定[38]。

2 膜蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

2.1 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

神經(jīng)系統(tǒng)對機體生理功能活動的調(diào)節(jié)十分重要，其細胞膜表面的蛋白發(fā)揮著重要的生理功能。Melo-Braga等用膜蛋白組學(xué)的方法比較了胚胎干細胞與神經(jīng)干細胞的區(qū)別，鑒定出了2910個具有跨膜區(qū)域或信號肽的膜蛋白，指出Crumbs 2可能為神經(jīng)干細胞的標(biāo)志物[39]。Dagley等研究了小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘膜蛋白質(zhì)組，采用18O標(biāo)記同時定性定量了超過1000種髓鞘蛋白，并發(fā)現(xiàn)了髓鞘中的標(biāo)志性蛋白[40]。

突觸體是由神經(jīng)細胞末梢的突觸前、突觸間隙、突觸后膜所組成的囊性結(jié)構(gòu)，能夠發(fā)揮突觸的基本功能，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)功能及其疾病的研究。Bosch等通過研究背側(cè)紋狀體的突觸蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)冰毒可使神經(jīng)保護（neuroprotection）、神經(jīng)可塑性（neuroplasticity）、細胞骨架（cell cytoskeleton）、能量調(diào)節(jié)（energy regulation）等相關(guān)的84個蛋白發(fā)生改變，確定amphiphysin與成癮相關(guān)[41]。Gy?rffy等通過脂多糖來激活孕期母體的免疫反應(yīng)，通過研究子代的突觸體蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突觸前的囊泡轉(zhuǎn)運蛋白（vesicle trafficking），突觸后的骨架蛋白（cytoskeleton）、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）的蛋白也發(fā)生了改變，而這些蛋白均參與了精神分裂癥和自閉癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，該研究證實了母體免疫激活（MIA）可能會增加子代患精神疾病的概率[42]。文獻[43]研究了抑郁小鼠突觸后致密層（PSD）的蛋白質(zhì)組學(xué)，共發(fā)現(xiàn)1500多個蛋白，其中74個膜蛋白與對照組相比表達量顯著增加，進一步分析顯示這些致密層的膜蛋白參與了信號傳導(dǎo)及突觸功能的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)了一系列與抑郁相關(guān)的包括NMDA受體亞單位NR2A在內(nèi)的膜蛋白，這些膜蛋白可能成為治療抑郁的新靶點。在突觸體的制備過程中，常常伴隨著神經(jīng)膠質(zhì)體（gliosomes）的產(chǎn)生，通過密度梯度離心可以進一步純化神經(jīng)膠質(zhì)體，神經(jīng)膠質(zhì)體的蛋白質(zhì)組學(xué)[44]發(fā)現(xiàn)其富含不同種類的星形膠質(zhì)細胞蛋白（如VAMP3、Ezrin、Basigin）和G-蛋白介導(dǎo)的信號蛋白。

2.2 與腫瘤相關(guān)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

腫瘤的早期診斷及治療是世界性難題，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物（maker）很多屬于蛋白質(zhì)，如甲胎蛋白（AFP）、血清癌胚抗原（CEA）、前列腺特異抗原（PSA）等，由于細胞膜表面存在特異性的抗原，針對特定腫瘤的靶向治療收到人們的廣泛關(guān)注，而基于質(zhì)譜的膜蛋白質(zhì)組學(xué)是促進該研究的有力手段[45]。

Martinez-Pinna等比較了腹主動脈瘤患者和正常人體內(nèi)紅細胞膜蛋白的差異，質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，有39個膜蛋白發(fā)生了顯著改變，包括膜的結(jié)構(gòu)蛋白（spectrins、ankyrin）、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白（catalase、peroxiredoxin-2）等[46]。為表征膠質(zhì)母細胞瘤的侵蝕性，Izabela等通過研究9種膠質(zhì)母細胞瘤的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了49種與腫瘤侵蝕密切相關(guān)的膜蛋白，包括與預(yù)后密切相關(guān)的 ITGA5（integrin alpha5）、CD97、ANXA1（annexin A1）[47]。通過提取大腸息肉組織、未轉(zhuǎn)移的大腸癌組織及轉(zhuǎn)移的大腸癌組織的膜組分，應(yīng)用Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其中的1567個蛋白至少含有一個跨膜區(qū)域，息肉與癌組織相比差異表達的膜蛋白有159個；而轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的癌組織相比，差異表達的膜蛋白有32個[48]。Gao等研究了胃癌組織及其癌旁組織的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，用TMT標(biāo)記技術(shù)同時定性定量了135個細胞膜或膜相關(guān)蛋白，其中的82個膜蛋白發(fā)生了顯著變化，包括已知的annexin A6、caveolin 1、epidermal growth factor receptor、integrin beta 4等胃癌標(biāo)志物，指出flotillin 1可能是另一個潛在的胃癌標(biāo)志物[49]。采用兩相提取法提取ErbB2過表達的乳腺癌細胞、3種ErbB2陰性癌細胞及良性乳腺細胞的膜蛋白，經(jīng)過Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞與酪氨酸激酶、細胞粘附分子等相關(guān)蛋白的異常表達密切相關(guān)，是造成乳腺腫瘤細胞無限制生長的重要原因[50]。Yan等比較了頭頸部鱗狀細胞腫瘤與周圍組織的膜蛋白差異，發(fā)現(xiàn)有123個膜蛋白上調(diào)或下調(diào)1.5倍以上，主要涉及CD166和CD44，而CD166更合適作為該腫瘤的marker[51]。Mermelekas[52]和Shukla[53]針對從膜蛋白中找到腫瘤標(biāo)志物的技術(shù)要點及存在的問題進行了進一步的綜述。

惡性膠質(zhì)瘤，約占52%的原發(fā)性腦部惡性腫瘤，特別是膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞（GSCs）對放療或化療均不敏感，且易于復(fù)發(fā)，而基于膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)了其表面的抗原或治療靶點，為GSCs的治療提供了新的放向[54]。對于染色體復(fù)雜易位的多發(fā)性骨髓瘤，t（4,14）異常的比例約占該類腫瘤的10～20%，針對該位點發(fā)現(xiàn)其細胞膜表面的標(biāo)志物，隨后可有目的的設(shè)計小分子藥物或抗體，Zhi等研究了骨髓瘤細胞KMS11和敲低該基因的KMS11細胞的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了50個差異表達的膜蛋白，其中SLAMF7可以作為治療該腫瘤的藥物設(shè)計靶點[55]。通過比較人正常粒細胞與5種骨髓性白血病瘤細胞系膜蛋白的差異，在320個膜蛋白中，CD166/ALCAM蛋白在這5種腫瘤細胞系中的表達明顯增加，據(jù)此將多米卡新（duocarmycin）作為治療藥物，取得了較好的抗腫瘤效果[23]。

2.3 關(guān)于膜蛋白質(zhì)組學(xué)的其它應(yīng)用研究

外泌體是由多數(shù)細胞（包括細菌、真核生物等）所分泌的，一般為納米尺寸的微型囊泡膜結(jié)構(gòu)，發(fā)揮免疫調(diào)控、血管生成、細胞遺傳物質(zhì)和功能蛋白的轉(zhuǎn)移等功能，特別是其表面的膜蛋白參與了多種病理生理過程，是疾病檢測及治療的重要靶點[56]。Choi等研究了由銅綠假單胞菌（Pseudomonas putida）KT2440所產(chǎn)生的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)，鑒定出了其表面的膜蛋白（OprC、OprD、OprE、OprF、OprH、OprG、OprW），該外泌體對培養(yǎng)的人來源肺細胞無明顯的毒性作用，可以作為治療藥物或抗體的載體以治療某些人類疾病[57]。

人們應(yīng)用膜蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了很多有趣的現(xiàn)象，Van等研究不同腸段的膜蛋白差異，結(jié)果顯示多數(shù)膜蛋白在整個腸段的表達較穩(wěn)定，一些與細菌感應(yīng)（bacterial sensing）、陽離子轉(zhuǎn)運（cation transport）、O-糖基化（O-glycosylation）相關(guān)的蛋白的表達量從腸的近端至遠端逐漸降低，而與微生物防御（microbial defense）和陰離子轉(zhuǎn)運（anion transport）相關(guān)蛋白的表達量卻逐漸增加[58]。通過研究分化和未分化HepaGR細胞的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了一些與乙肝病毒（HBV）感染相關(guān)的膜蛋白，為防止HBV感染提供了新的治療靶點[59]。Waeowalee等研究了小鼠嗅覺上皮細胞的纖毛膜蛋白，鑒定出了62個嗅覺受體蛋白，首次在嗅球纖毛中發(fā)現(xiàn)了NCKX2蛋白，進一步研究指出4個膜聯(lián)蛋白ANXA1、ANXA2、ANXA5、S100A5參與了嗅覺的信號傳導(dǎo)[60]。Wang等研究了人晶狀體纖維細胞的膜蛋白及膜磷酸化蛋白，鑒定出的951個蛋白中有379個蛋白為跨膜蛋白或膜相關(guān)蛋白，這些蛋白參與了物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及肌動蛋白的調(diào)節(jié)；在TiO2富集的膜磷酸化蛋白中，在271個膜蛋白中找到了855個磷酸化位點，有455個磷酸化位點屬于首次被發(fā)現(xiàn)，PKA、PKC、CKII、p38MAPK、RSK為主要的磷酸化激酶[61]。

Liu等研究了腎臟血管內(nèi)皮的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，他們先用灌流液灌流動物腎臟，再注入二氧化硅納米顆粒的膠體溶液，從而富集到腎血管內(nèi)皮的細胞膜蛋白，此法共鑒定出了582個腎血管內(nèi)皮細胞的膜蛋白及1205個腎降解蛋白，包括16個內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白（asintegrin beta-1、intercellular adhesion molecule-2(ICAM-2)等），8個新的內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白（如Deltex 3-like protein、PICALM等）[62]。針對關(guān)節(jié)軟骨細胞的膜蛋白，Matta等以Triton X-114為溶劑進行不同溫度下的兩相膜蛋白提取，結(jié)果指出，CD276、S100-A6、VDAC異構(gòu)體蛋白是該細胞的標(biāo)志性膜蛋白[63]。

3 展望與不足

近年來，為了增加膜蛋白的鑒定數(shù)目、增加定量的可靠性、縮短樣品的前處理時間，人們開發(fā)了一些新的方法。被文獻稱之為Short GeLC-SWATH的方法，與膠內(nèi)裂解相比，處理時間大大縮短，但鑒定出的膜蛋白數(shù)目并不少，與SWATH數(shù)據(jù)采集方式相結(jié)合，提高了膜蛋白定量的重復(fù)性[64]。Zhou等采用了一種集膜蛋白提取、酶解、分組為一體的“Centrifugal Proteomic Reactor”，將該裝置用到大鼠肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜蛋白的鑒定中，發(fā)現(xiàn)了至少800種以往很難被鑒定到的膜蛋白[17]。Christoforou報道了一種被稱為hyperLOPIT的方法，該法基于蛋白的TMT標(biāo)記，肽段被碎裂后再同時選擇10個該肽段的二級碎片離子進一步碎裂，用MS3的TMT標(biāo)簽進行定量，與傳統(tǒng)的TMT MS2定量相比，可以達到傳統(tǒng)MS2定量的靈敏度，但消除了離子的抑制效應(yīng)，定量的準(zhǔn)確度大幅提高[65]。

基于質(zhì)譜的非依賴性數(shù)據(jù)采集（DIA）、多反應(yīng)監(jiān)測或選擇粒子監(jiān)測（MRM/SRM）、平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）等蛋白的定量方法同樣適用于膜蛋白的定量[66,67]，如用SRM質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的方式研究細胞膜轉(zhuǎn)運體的含量變化，Qiu等概述了該法的詳細流程及要點[68]，隨著質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，基于質(zhì)譜的蛋白定量技術(shù)有望成為Western Blot檢測蛋白的替代技術(shù)。

基于質(zhì)譜的Shotgun膜蛋白質(zhì)組學(xué)還存在一些問題，如非膜成分的污染、富集過程相對復(fù)雜、蛋白覆蓋度低、實驗室間定量結(jié)果的可重復(fù)性差；還需要額外的手段（如：進一步的富集）才能同時研究膜蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后修飾；另外，由于存在一定的假陽性率，鑒定出的膜蛋白還需采用免疫共沉淀、Western Blot等手段進行佐證。相信隨著儀器分析技術(shù)、生物信息學(xué)、計算機技術(shù)、化學(xué)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，基于質(zhì)譜的膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也會進一步縱向發(fā)展，解決更多的與膜蛋白相關(guān)的生命難題。