基于氣質(zhì)聯(lián)用的保元湯抗缺氧作用代謝組學(xué)研究＊

楊 茜，黃榮清，肖炳坤，楊建云

（軍事醫(yī)學(xué)研究院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850）

保元湯由人參、黃芪、甘草、肉桂四味中藥材組成，其中人參、黃芪為我國傳統(tǒng)滋補(bǔ)養(yǎng)生的名貴藥材，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、生津養(yǎng)血等功效[1]。甘草可補(bǔ)脾益氣、緩急止痛，調(diào)和諸藥[2,3]。肉桂引火歸元，溫腎助陽，是一味性大熱的中藥材[4,5]。保元湯方以人參、黃芪大補(bǔ)元?dú)猓鲋臍?；甘草炙用，甘溫益氣，通?jīng)利脈，行血?dú)猓蝗夤鹦翢嵫a(bǔ)陽，溫通血脈，是常用的補(bǔ)氣名方之一[6]。《張氏醫(yī)通·祖劑》中對此方高度評價，將此方稱為補(bǔ)氣諸方之首[7]。后世醫(yī)家也以保元湯方劑為本，形成諸多衍化方，其影響力可見一斑。

代謝組學(xué)是近年來快速發(fā)展的一門新學(xué)科，它的研究對象是代謝組在某一時刻或某種狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)所有的代謝物變化情況等，通過考察生物體受到外界刺激或給藥前后時點(diǎn)狀態(tài)，研究代謝產(chǎn)物圖譜動態(tài)變化的整體情況[8]。通過了解這些代謝組小分子物質(zhì)在不同條件不同時點(diǎn)下的量變，有助于理解整個動態(tài)生理變化過程，以此來研究一些疾病發(fā)展、藥物治療以及毒理機(jī)制等[9-11]。代謝組學(xué)將代謝組作為一個整體來進(jìn)行研究，與中藥方劑中整體性和動態(tài)性原則十分相似，對于成分復(fù)雜的中藥方劑來講，代謝組學(xué)的研究方法無疑為方劑研究提供了全新研究思路[12,13]。

本實(shí)驗(yàn)以代謝組學(xué)為基本思路，利用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)，對保元湯在KM小鼠常壓耐缺氧模型中的干預(yù)作用進(jìn)行研究，探討并闡述保元湯在該模型中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥材

保元湯全方：紅參（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號701002387A），黃芪（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號170510），炙甘草（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號170510），肉桂（北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，批號160116）

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

選取雄性昆明種小鼠體重18～20 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK-(軍)2012-0004。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），LGJ-25C冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司)；Media Water Purifier凈水機(jī)（佛山市美麗清湖凈水設(shè)備有限公司）；DL-1-15高級臺式封閉電爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴槽（上海亞榮生化儀器廠）；QL-901Vortex型渦旋儀(其林貝爾儀器制造有限公司)；BP211D型天平(德國Sartorius公司)；NV-15G型氮吹儀（成都賽斯特儀器儀表有限公司）；IDZ5-2型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GC/MS—QP2010SE氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；BC-2600全自動血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

1.3.2 試劑

乙腈（賽默飛世爾科技（中國）有限公司)；甲醇(賽默飛爾科技（中國）有限公司)；甲氧氟鹽酸鹽（sigma公司）；BSTFA+TMCS(99：1)(sigma公司)；吡啶（天津市博迪化工有限公司）；庚烷(梯希愛（上海）化工生產(chǎn)發(fā)展有限公司)；

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 保元湯煎劑制取

取紅參150 g，黃芪225 g，甘草（炙用）75 g，肉桂37.5 g，加入10倍量水浸泡過夜后煎煮1 h，用紗布過濾后收集濾液，第二次和第三次煎煮分別加入5倍量水和3倍量水，煎煮30 min，同樣以紗布過濾收集濾液，合并三次濾液，旋蒸濃縮后置于凍干機(jī)進(jìn)行凍干，獲得保元湯煎劑凍干粉末。

1.4.2 保元湯對小鼠抗缺氧能力干預(yù)

將64只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白組、模型組、陽性對照組（普萘洛爾灌胃給藥0.520 mg·kg-1）、保元湯低劑量組（水煎液84.5 mg·kg-1）、保元湯中劑量組（水煎液254 mg·kg-1）、保元湯高劑量組（水煎液507 mg·kg-1），每組8只。每日灌胃1次，連續(xù)12 d。末次灌胃1 h后，將各組小鼠分別放入盛有15 g鈉石灰的250 mL具塞廣口瓶內(nèi)，用凡士林涂抹瓶塞密閉瓶口后，立刻開始計時，直至小鼠呼吸停止時間。以該時間為指標(biāo)，比較各組小鼠的常壓抗缺氧能力。將呼吸停止后的小鼠進(jìn)行腹主動脈取血，12000 rpm·min-1離心后獲得血清待衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。

1.4.3 血常規(guī)分析

將呼吸停止后的小鼠立即腹主動脈取血10 μL，放入血液分析儀配套稀釋液中稀釋并搖勻，直接使用血液分析儀進(jìn)樣分析，得到血常規(guī)分析數(shù)據(jù)。

1.4.4 GC-MS分析

前處理（衍生化）：吸取血清100 μL至2 mL EP管中，加入1200 mL甲醇，渦旋1 min后超聲15 min，放入離心機(jī)以12000 rpm·min-1離心15 min，去除血清中蛋白。取200 μL上清液至2 mL玻璃小瓶后放入氮吹儀，60℃溫度下進(jìn)行氮?dú)獯蹈?。吹干后加?0 μL的20 mg·mL-1甲氧氟吡啶試劑，渦旋30 s復(fù)溶，隨后放入70℃水浴加熱1 h進(jìn)行肟化處理。水浴后冷卻至室溫，加入硅烷化試劑BSTFA+TMCS(99∶1)試劑75 μL，渦旋30 s混勻后，再次放入70℃水浴中加熱1h進(jìn)行衍生。水浴后再次冷卻至室溫，加入100 μL庚烷，渦旋30 s混勻，過0.2 μm濾膜后得到衍生樣品，待GC-MS上機(jī)分析。

GC-MS條件參數(shù)設(shè)定：儀器使用自動調(diào)諧方式進(jìn)行調(diào)諧。設(shè)定參數(shù)：接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；電離方式為EI源，轟擊能量70 eV；倍增電壓：1.0 kV；掃描方式：全掃描。色譜柱：RESTEK RX-5 Ms(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣：氦氣；流速：1.0 mL·min-1，分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣體積：1 μL；升溫程序：80℃（0 min）→80℃(5 min)→300℃(60 min)→300℃(70 min)。

1.4.5 代謝標(biāo)志物尋找及代謝通路分析

將正常組與模型組GC-MS數(shù)據(jù)使用XCMS預(yù)處理后，導(dǎo)入SIMCA-P11.5進(jìn)行變量權(quán)重分析（VIP值），篩選VIP值＞1.5的變量。結(jié)合荷質(zhì)比與保留時間參數(shù)，導(dǎo)入GC-Solution(NIST2008質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫)中確認(rèn)潛在標(biāo)志物化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過檢索Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）和 Human Metabolome Data－base（HMDB）在線數(shù)據(jù)庫確認(rèn)代謝標(biāo)志物結(jié)構(gòu)。同時，將篩選出的代謝標(biāo)志物使用SPSS 22.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，排除不具有顯著性差異（P＞0.05）的變量。最終確認(rèn)生物標(biāo)志物后，將其導(dǎo)入MetaboAnalyst在線分析代謝通路。

表1 保元湯對常壓缺氧小鼠死亡時間影響表（x±s，n=8）

表2 RBC、HBC、HCT分析結(jié)果對比表

圖1 正常組、模型組、高劑量給藥組及陽性對照組TIC圖

2 結(jié)果與分析

2.1 常壓抗缺氧實(shí)驗(yàn)不同組別小鼠死亡時間

各組別小鼠死亡時間如表1所示，對各組小鼠常壓抗缺氧死亡時間進(jìn)行分析，與模型組相比較，保元湯低劑量組具有顯著差異（P＜0.05），保元湯中劑量組和高劑量組、陽性對照組具有極顯著差異（P＜0.01），保元湯不同計量組死亡時間有上升趨勢，但組間無顯著性差異。同時保元湯各個劑量組與陽性對照組無顯著性差異，即保元湯與普萘洛爾具有相同常壓抗缺氧作用，造模成功。

2.2 血常規(guī)分析

通過血液分析儀對白細(xì)胞數(shù)目WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)目Lymph#、單核細(xì)胞數(shù)目Mon#、中性粒細(xì)胞數(shù)目Gran#、紅細(xì)胞數(shù)目RBC、血紅蛋白HBC、紅細(xì)胞壓積HCT、血小板數(shù)目PLT進(jìn)行分析比較，其中RBC、HBC、HCT三項(xiàng)空白組和模型組出現(xiàn)顯著性差異，同時模型組與不同劑量給藥組間出現(xiàn)差異，結(jié)果如表2所示。

分析各組小鼠在RBC、HBC、HCT數(shù)據(jù)差異，保元湯低劑量組雖出現(xiàn)數(shù)值上升，但與模型組相比，無顯著性差異。而給藥中劑量和高劑量組與模型組相比，則分別體現(xiàn)出顯著性差異和極顯著性差異，陽性對照普萘洛爾在該項(xiàng)目中變化不大。

圖2 正常組與模型組OPLS-DA分析結(jié)果

2.3 GC-MS分析結(jié)果

按照1.4.4所述方法，將各組小鼠血清衍生前處理后，使用GC-MS進(jìn)行分析，正常組、模型組、高劑量給藥組及陽性對照組總離子流圖（Total Ion Current,TIC）（圖1）。

2.4 代謝組學(xué)分析

2.4.1 正常組與模型組OPLS-DA分析結(jié)果及潛在代謝標(biāo)志物尋找

圖3 不同計量組PLS-DA分析結(jié)果

圖4 代謝分析影響值圖

正常組與模型組血清樣品GC-MS分析結(jié)果經(jīng)XCMS處理后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P11.5分離分析，R2X=0.689，R2Y=0.991，Q2=0.907，排除過渡擬合現(xiàn)象。正常組與模型組分開（圖1），根據(jù)VIP值大于1.5初步篩選確認(rèn)47個潛在的標(biāo)志代謝物。

2.4.2 保元湯對小鼠常壓抗缺氧作用

保元湯各劑量組干預(yù)小鼠常壓抗缺氧模型后，將GC-MS分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst4.0進(jìn)行PLS-DA分析，（圖2）。保元湯三個劑量組有交叉部分，但高劑量組明顯與空白組更為接近，證明保元湯劑量與小鼠常壓抗缺氧作用相關(guān)，高劑量給藥組干預(yù)作用最強(qiáng)。

表3 代謝標(biāo)志物及峰面積比較表

2.4.3 代謝物標(biāo)志物獲取及峰面積比較

在2.4.1初步分析基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對潛在代謝標(biāo)志物進(jìn)行篩選。通過比對GC-MS的總離子流圖（TIC圖），同時通過SPSS軟件篩選具有統(tǒng)計學(xué)差異的峰，最終共發(fā)現(xiàn)25個內(nèi)源性代謝標(biāo)志物，分別為丙氨酸、乳酸、1-苯乙胺、甘氨酸、β-丙氨酸、異亮氨酸、乙酰甘氨酸、氨基丁酸、二甲基甘氨酸、絲氨酸、二乙胺、乙醇胺、酪胺、色胺、乙胺、蘇氨酸、2,3-丁二醇、琥珀酸、蘇糖酸、β-甘油磷酸、N-乙酰-L-賴氨酸、丁胺、赤蘚糖、巖藻糖、肌醇-1-磷酸。該25個代謝標(biāo)志物在正常組、模型組、對照組和高劑量給藥組峰面積變化表如表3所示，模型組與正常組相比，代謝標(biāo)志物峰面積均存在顯著性差異（P＜0.05）或極顯著性差異（P＜0.01）。高劑量給藥組與正常組相比，除異亮氨酸與二甲基甘氨酸顯著性升高外，其余各代謝標(biāo)志物均無顯著性差異，意味著高劑量給藥組已恢復(fù)至正常水平。

2.4.4 代謝通路分析

將2.4.3中發(fā)現(xiàn)的代謝標(biāo)志物導(dǎo)入MetaboAnalyst4.0中進(jìn)行代謝通路在線分析，得到29條通路分析詳細(xì)結(jié)果，通路分析影響值如圖3所示。綜合Impact＞0.1及相關(guān)文獻(xiàn)分析，保元湯干預(yù)小鼠常壓抗缺氧模型最密切的4條代謝路徑分別為①甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝路徑（Glycine,serine and threonine metabolism），②氨酰-tRNA合成(AminoacyltRNA biosynthesis)，③纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝路徑（Valine,leucine and isoleucine biosynthesis 2），④β-丙氨酸代謝路徑（beta-Alanine metabolism）。

3 討論

小鼠常壓抗缺氧實(shí)驗(yàn)建立在將小鼠置于密閉環(huán)境下，隨著小鼠對氧氣的消耗和瓶中二氧化碳體積分?jǐn)?shù)的增加，最終造成小鼠缺氧后呼吸中樞抑制而死亡，同時腦和心臟缺血也是死亡的重要原因[14]。本實(shí)驗(yàn)以保元湯灌胃給藥干預(yù)后，各劑量給藥組小鼠死亡時間均有顯著性延長，對其可能機(jī)制進(jìn)行分析如下：

首先，在血常規(guī)分析中可明顯看到保元湯中、高劑量給藥組在紅細(xì)胞數(shù)目RBC、血紅蛋白HGB、紅細(xì)胞壓積HCT上的明顯升高。紅細(xì)胞是哺乳動物體內(nèi)血液運(yùn)送氧氣的主要媒介，其數(shù)量的增多必然有利于增加血液的運(yùn)氧能力[15]。紅細(xì)胞中含有的血紅蛋白是由珠蛋白和亞鐵血紅素結(jié)合而成，同樣在血液的氣體運(yùn)輸中起到重要作用[16]。紅細(xì)胞、血紅蛋白的增高，整體上均有利于血液攜氧，是保元湯具有顯著抗缺氧效應(yīng)的原因之一。

其次在血清GC-MS代謝組學(xué)分析中，最終得到的代謝標(biāo)志物主要集中在氨基酸類小分子物質(zhì)變化上。根據(jù)周軍利[17]等的研究，甘氨酸對缺氧大鼠心肌細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，可能機(jī)制為甘氨酸與心肌細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合，減輕心肌細(xì)胞膜去極化，從而減少Ca2+通道開放使Ca2+內(nèi)流減少，發(fā)揮保護(hù)作用。在空白組與模型組對比中也發(fā)現(xiàn)，模型組血清中甘氨酸濃度明顯下降，可能也與這一作用有關(guān)。

氨酰-tRNA合成通路變化則提示了氨基酸體內(nèi)合成的變化情況。在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄翻譯過程中，tRNA分子會與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合，然后將其運(yùn)送至核糖體進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。在連接反應(yīng)中，首先在酶的作用下，ATP與氨基酸結(jié)合并消耗能量釋放焦磷酸，形成氨酰-AMP復(fù)合物，接下來該復(fù)合物與對應(yīng)tRNA結(jié)合并運(yùn)輸。氨基酸與tRNA之間形成被稱作氨酰-tRNA鍵的高能鍵，在蛋白質(zhì)合成的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[18]。因此，如果氨酰-tRNA合成發(fā)生障礙，則必然會影響到蛋白質(zhì)合成。本研究中甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸代謝產(chǎn)物變化，提示常壓抗缺氧模型中可能存在涉及蛋白質(zhì)翻譯過程的變化。

此外，代謝標(biāo)志物中的β-丙氨酸是?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑，可與Tau-T競爭性結(jié)合，抑制?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)。而?；撬嶙鳛槿梭w一種具有特殊生理功能的氨基酸，有一定對心肌細(xì)胞的保護(hù)能力[19,20]，在抗缺氧能力中也發(fā)揮著一定作用。