DKK1基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建及其在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12中的表達(dá)

李慧華，仝書嚴(yán)，陳銳，張才溢，耿德勤

(徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州221004)

Dickkop-1(DKK1)是DKK蛋白家族成員之一。DKK1基因是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑。DKK1基因可參與誘導(dǎo)頭部的產(chǎn)生，在胚胎發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸形成等體內(nèi)多種病理生理過程中發(fā)揮作用[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)DKK1基因表達(dá)異常，可引起認(rèn)知障礙、情緒異常等神經(jīng)精神疾病[3，4]。近年尸檢發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病(AD)患者腦組織DKK1基因表達(dá)增加。小鼠海馬組織DKK1表達(dá)隨年齡增加而增加，并伴有空間工作記憶障礙。DKK1基因在AD中的作用引起了越來越多的關(guān)注[5，6]。此外，DKK1基因還在腫瘤及腎臟、肝臟、骨疾病中發(fā)揮重要作用[7，8]。大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞作為類神經(jīng)元細(xì)胞，在結(jié)構(gòu)、功能上與神經(jīng)元有很多相似之處，但較神經(jīng)元容易培養(yǎng)，常用于神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病的體外研究[9]。2016年6月～2017年6月，本研究選用PC12細(xì)胞為研究對象，建立穩(wěn)定細(xì)胞系，為進(jìn)一步探討DKK1基因在神經(jīng)精神疾病中的作用及分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 目的基因DKK1 (NM_001106350)、慢病毒載體質(zhì)粒GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)、慢病毒包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0和E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)菌、293T細(xì)胞(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；PC12細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI1640培養(yǎng)基(Cyclone)，胎牛血清(Gemini)，嘌呤霉素(Selleck)，蛋白裂解液 (上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司)，DKK1抗體(Abcam)，β-actin抗體(Santa Cruz)，限制性內(nèi)切酶AgeI(NEB)、Taq DNA聚合酶(SinoBio)，dNTP(Takara)，Primer(捷瑞生物)，In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech)，質(zhì)粒抽提試劑盒(Promega)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化)，Lipofectmine 2000(invitrogen)，SYBR?qPCR Mix(Roche)。

1.2 DKK1基因擴(kuò)增 采用RT-PCR法。參考GenBank中DKK1的cDNA編碼序列(NM_001106350)，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，交由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成引物序列。DKK1基因上游引物序列：5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACGGTTGTGCGTGCAGTGGCAG-3′，下游引物序列：5′-TCCTTGTAGTCCATACCGTGTCTCTGGCAGGTGTGGAGCCTG-3′(在上下游引物5端分別加入限制性內(nèi)切酶AgeI/AgeI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)。以含有DKK1基因的cDNA庫為模板，擴(kuò)增DKK1基因序列。PCR反應(yīng)體系：98 ℃預(yù)變性5 min、98 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物大小854 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收RT-PCR產(chǎn)物。

1.3 DKK1基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶AgeI/AgeI對GV358載體進(jìn)行酶切，使其線性化。瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物。將線性化的GV358載體DNA和DKK1基因酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系：ddH2O 2.5 μL，5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，酶切后的載體DNA 2.5 μL，純化后的PCR產(chǎn)物片段2 μL，ExnaseTMⅡ 1 μL；于37 ℃反應(yīng)30 min，隨后置于冰水浴中冷卻5 min后立即轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)菌。將細(xì)菌接種于含有氨芐青霉素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取重組陽性克隆行PCR初步鑒定后及送測序。PCR鑒定上游引物：5′-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3′，下游引物：5′-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′，產(chǎn)物1 005 bp。反應(yīng)體系包括：ddH2O 9.2 μL，2× Taq Plus Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，單個(gè)菌落，總體積20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，保存。采用空載體質(zhì)粒為陰性對照組，有GAPDH的載體為陽性對照組，排除假陰性和假陽性結(jié)果。對PCR陽性克隆片段進(jìn)行測序。

1.4 重組慢病毒的包裝及滴度測定 GV358-DKK1基因慢病毒載體系統(tǒng)包裝：取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，胰酶消化后接種于直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將GV358-DKK1質(zhì)粒和兩種病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，采用Lipofectamine2000脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，包裝293T細(xì)胞。培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集上清，離心去除細(xì)胞碎片；0.45 μm濾器過濾，超速離心濃縮后收集病毒濃縮液，-80 ℃保存。將293T細(xì)胞按4×104/孔接種96孔板，分別加入逐孔稀釋法稀釋的病毒液，48 h后觀察熒光表達(dá)情況，估計(jì)慢病毒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的效率。同時(shí)設(shè)立空載體對照組。收取細(xì)胞抽取基因組DNA并做定量PCR檢測，計(jì)算滴度，公式：qPCR滴度=N×C/V。N為感染時(shí)24孔板中對應(yīng)孔的細(xì)胞數(shù)量，C(每個(gè)細(xì)胞中含有的慢病毒個(gè)數(shù))=(A拷貝數(shù)/B拷貝數(shù))×2，V為對應(yīng)孔中感染的慢病毒體積。

1.5 PC12細(xì)胞感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選 PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于6孔板中，第2天細(xì)胞密度50%左右進(jìn)行病毒感染。將細(xì)胞隨機(jī)分為三組，空白對照組、空載體陰性對照組、PC12-DKK1組，空載體陰性對照組、PC12-DKK1組分別用制備的空載體慢病毒(GV358-Vector)及GV358-DKK1顆粒進(jìn)行感染，24 h后更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；空白對照組常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)嘌呤霉素(終濃度1.5 μg/mL)篩選2周后獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。

1.6 PC12細(xì)胞中DKK1 mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-RCR技術(shù)。收集三組細(xì)胞，分別加入TRIzol等提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度；RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCA-3′、下游5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′；DKK1引物序列上游5′-TTGACAACTACCAGCCCTACCC-3′、下游5′-CTCGAGGTAAATGGCTGTGGTC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.7 PC12細(xì)胞內(nèi)DKK1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集三組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，計(jì)算上樣量，配制10% SDS-PAGE凝膠，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后分別用一抗DKK1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗2 h，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描。采用Image J軟件分析條帶灰度值，用DKK1灰度值比內(nèi)參灰度值作為DKK1蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 GV358-DKK1慢病毒載體的構(gòu)建結(jié)果 用設(shè)計(jì)的DKK1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見大小約為854 bp的特異性條帶?？股睾Y選菌落，PCR對重組子進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出大小為1 005 bp的陽性克隆片段，對陽性克隆菌進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致。證明GV358-DKK1慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.2 慢病毒包裝及病毒滴度測定結(jié)果 三質(zhì)粒(GV358-DKK1/GV358-vector、Helper1.0、Helper2.0)共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后熒光顯微鏡下見大量綠色熒光，約95%以上且熒光強(qiáng)度高，293T細(xì)胞生長狀態(tài)好，表明慢病毒包裝成功且轉(zhuǎn)染效率高。收集、濃縮病毒后逐孔稀釋滴度測定法測定GV358-vector和GV358-DKK1的滴度分別為6×108、2×108TU/mL。

2.3 PC12細(xì)胞慢病毒感染結(jié)果 慢病毒感染PC12細(xì)胞72 h后可見少許熒光。用嘌呤霉素連續(xù)篩選2周后，熒光顯微鏡下所有細(xì)胞可見綠色熒光，感染效率大于95%。

2.4 感染后各組細(xì)胞內(nèi)DKK1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 空白對照組、空載體陰性對照組、PC12-DKK1組細(xì)胞DKK1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.02±0.27、0.97±0.24、133.74±0.93，DKK1蛋白相對表達(dá)量分別為1.02±0.14、1.06±0.12、1.48±0.21。PC12-DKK1組DKK1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均較空載體陰性對照組和空白對照組高(P均<0.05)。

3 討論

DKK家族由4個(gè)成員(DDK-1、DDK-2、DDK-3、DDK-4)組成[10，11]。1998年，Glinka等首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎頭部發(fā)育的誘導(dǎo)機(jī)制中發(fā)現(xiàn)、克隆并定義了DKK1及其家族。DKK1是DKK家族中被研究最多的成員。研究發(fā)現(xiàn)，人類DKK1基因位于10號染色體10q11，約3.5 kb，由266個(gè)氨基酸組成的分泌型糖蛋白[12]。DKK1結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)保守的半胱氨酸區(qū)域，輔脂肪酶折疊區(qū)域可與膜受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白Kremen1/2結(jié)合形成三聚體、內(nèi)吞，阻斷Wnt-Frizzled-LRP5/6復(fù)合物形成，進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)信號分子β-catenin磷酸化，使其泛素化，在胞質(zhì)內(nèi)被水解，阻斷β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF、LCF結(jié)合，起到負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt信號通路的作用[13]。Wnt信號通路在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)可塑性中起重要作用，并且與記憶學(xué)習(xí)功能關(guān)系密切，Wnt通路的異?？赡苁钦J(rèn)知損傷的潛在發(fā)生機(jī)制[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)，DKK1基因可能作為各種刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)，參與該機(jī)制的調(diào)控[16]。DKK1基因啟動子包含1個(gè)p53應(yīng)答元件，誘導(dǎo)DKK1基因的表達(dá)[17]。此外，紫外線和化學(xué)治療劑引起的基因毒性增強(qiáng)了DKK1基因表達(dá)，DKK1基因使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。本課題組前期亦發(fā)現(xiàn)DKK1基因可降低PC12細(xì)胞活性、促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡[18]。目前未見類似DKK1過表達(dá)重組慢病毒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞的研究報(bào)道。

近期研究發(fā)現(xiàn)，DKK1基因與許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)退化有關(guān)，包括AD、腦缺血和顳葉癲癇等。在細(xì)胞和動物的興奮毒性、β淀粉樣毒性、短暫性腦缺血和誘發(fā)癲癇的動物模型中DKK1基因的產(chǎn)生早于神經(jīng)元退化[19]。隨著人們對DKK1基因在神經(jīng)精神疾病中所起作用認(rèn)識的深入，以DKK1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的機(jī)制研究不斷增加。使用慢病毒作為載體可以提高病毒轉(zhuǎn)染效率，具有獲得病毒周期短、滴度高的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過三質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建高表達(dá)GV358-DKK1的慢病毒載體，用適當(dāng)濃度病毒液感染PC12細(xì)胞，嘌呤霉素連篩2周后熒光顯微鏡下均見綠色熒光，說明GV358-DKK1成功感染PC12細(xì)胞。隨后證實(shí)DKK1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均提高，進(jìn)一步說明本實(shí)驗(yàn)成功獲得DKK1基因高表達(dá)PC12細(xì)胞株。為后續(xù)探討DKK1基因的功能、特性及在神經(jīng)精神疾病中的作用提供理想的細(xì)胞模型。

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