蕪湖地區(qū)飲用水中四環(huán)素類抗生素含量檢測(cè)分析

丁苗苗，金 晨，胡春媛，于 榮，劉 飛，文育鋒

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.公共衛(wèi)生學(xué)院;2.檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

用于人類和動(dòng)物的抗生素30%～90%可以通過(guò)尿液和糞便排泄到水環(huán)境中，且大部分未代謝，常規(guī)廢水和再循環(huán)水處理只能部分去除或降解，抗生素殘留已被公認(rèn)為對(duì)健康有影響的新一類環(huán)境污染物[1]。當(dāng)前我國(guó)關(guān)于水環(huán)境中抗生素的殘留分析主要集中在海水、河水和城市污水，對(duì)飲用水中抗生素的污染調(diào)查及評(píng)估非常缺乏，飲用水中抗生素長(zhǎng)期低劑量暴露，可加劇致病微生物耐藥性的發(fā)展[2-4]，來(lái)自食物或飲用水中的抗生素暴露與兒童肥胖風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[5]，因此，開展飲用水中抗生素殘留檢測(cè)與評(píng)估的研究具有現(xiàn)實(shí)意義。

我國(guó)四環(huán)素類抗生素的使用占整個(gè)抗生素市場(chǎng)份額的15.8%，其在環(huán)境中降解后吸附力強(qiáng)，可長(zhǎng)期穩(wěn)定地存在于水環(huán)境中[6-7]，極易通過(guò)飲用水進(jìn)入人體從而影響健康。研究顯示在河流、湖泊、地下水中均檢測(cè)到四環(huán)素類抗生素的殘留[8-9]。在安徽地區(qū)，僅有王瑩[10]針對(duì)飲用水源及污水開展過(guò)抗生素污染相關(guān)研究，為評(píng)估蕪湖地區(qū)的飲用水抗生素殘留現(xiàn)狀，本研究以四環(huán)素類抗生素為目標(biāo)檢測(cè)物，對(duì)蕪湖地區(qū)飲用水中四環(huán)素類抗生素進(jìn)行檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器(U3000型，Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))；12位固相萃取裝置(57044型，Sepelco公司，美國(guó))；12位手動(dòng)氮吹儀(HGC-12A型，天津恒奧科技發(fā)展有限公司，中國(guó))；Sepelco HLB固相萃取小柱(200 mg/6 mL)；超純水發(fā)生器。

1.1.2 試劑 土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素4種標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，甲醇、乙腈、乙酸乙酯為色譜純，草酸與濃鹽酸為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及溶液配制 土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素4種標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配置成質(zhì)量濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液，在-18℃下避光保存；混合標(biāo)準(zhǔn)工作液現(xiàn)用現(xiàn)配，準(zhǔn)確吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于棕色容量瓶中，用超純水稀釋成所需的濃度。

1.3 樣本采集 在蕪湖市弋江區(qū)、鏡湖區(qū)、鳩江區(qū)、三山區(qū)、南陵縣、繁昌縣、蕪湖縣七個(gè)地區(qū)的居民家中采集自來(lái)水水樣，置于棕色瓶中保存，48 h內(nèi)上機(jī)測(cè)定。

1.4 樣品前處理 取1000 mL的末梢水，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2左右，以12 mL/min左右的流速通過(guò)Sepelco HLB固相萃取小柱，HLB小柱在使用前預(yù)先依次用10 mL甲醇和10 mL超純水活化，活化時(shí)要保持萃取小柱浸在溶液中，水樣萃取結(jié)束后負(fù)壓抽干小柱5 min，再用10 mL含10%甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫并收集，置于氮吹儀上氮?dú)獯蹈桑?0%的甲醇溶液定容至2 mL,樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

1.5 液相色譜條件 Thermo Fisher C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：40℃；流動(dòng)相A為甲醇，B為乙腈，C為0.01 mol/L草酸；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為365 nm。見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

時(shí)間/min流速/(mL/min)甲醇/%乙腈/%0．01mol/L草酸/%01149531102070815455010．515455011114952011495

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 參照GB/T 20764-2006《可食動(dòng)物肌肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測(cè)定液相色譜-紫外檢測(cè)法》，流動(dòng)相采用甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸(2+1+7)，4種藥物能得到有效分離，但峰型欠佳，保留時(shí)間較長(zhǎng)，懷疑是未進(jìn)行梯度洗脫的原因。故根據(jù)賀蘊(yùn)普等已發(fā)表的文獻(xiàn)[11]，流動(dòng)相參照其體系①方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸，同時(shí)采用梯度洗脫的方式，色譜峰之間分離良好，四個(gè)目標(biāo)峰峰型尖銳；參照其體系②方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L三氯乙酸，4種藥物分離效果良好，峰型尖銳，但出峰時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)；參照其體系③方法：甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸+0.01 mol/L三氯乙酸，在①的基礎(chǔ)上添加20%的三氯乙酸，并未出現(xiàn)原文中4種藥物的洗脫速度提升現(xiàn)象，反而出峰速度變慢且保留時(shí)間相對(duì)的延長(zhǎng)。因此本研究參照賀蘊(yùn)普體系①方法，選擇甲醇+乙腈+0.01 mol/L草酸為流動(dòng)相，并進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2 色譜圖結(jié)果 圖1為4種四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖，土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的保留時(shí)間分別為6.905、7.255、8.550、9.005 min,可見(jiàn)四種藥物分離效果良好，能在10 min內(nèi)完全洗脫，峰型尖銳。見(jiàn)圖1。

圖1 4種四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

2.2 線性范圍及方法檢出限 配制濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度均取20 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其線性范圍、線性方程與相關(guān)系數(shù)。在空白樣品中加標(biāo)液并稀釋，取信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限。見(jiàn)表2。

表2 4種四環(huán)素類抗生素的工作曲線

抗生素線性方程相關(guān)系數(shù)方法檢出限/(μg/L)土霉素y=0．6674x-0．00720．99980．0689四環(huán)素y=0．7416x+0．01060．99970．0272金霉素y=0．5070x-0．04890．99940．2241強(qiáng)力霉素y=0．4460x-0．00140．99990．0512

2.3 回收率與精密度 準(zhǔn)確吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白末梢水中，配制成濃度為0.1 mg/L和1 mg/L的加標(biāo)水樣，每個(gè)水平取7個(gè)平行進(jìn)樣，做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，4種四環(huán)素類抗生素的平均回收率為81.82%～151.11%，精密度良好。

表3 方法的回收率和精密度(n=7)

抗生素加標(biāo)濃度/(mg/L)實(shí)測(cè)值/(mg/L)回收率/%RSD/%土霉素0．10．0863586．357．4210．8766087．661．10四環(huán)素0．10．0839583．954．6810．8471884．720．73金霉素0．10．15111151．114．8710．8121481．217．04強(qiáng)力霉素0．10．0854685．468．4010．9201792．022．64

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定 用上述分析方法對(duì)21份蕪湖市居民家中的末梢水進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果水樣中四環(huán)素組分的濃度均低于檢出限，均未檢出4種抗生素。

3 討論

針對(duì)環(huán)境水體中四環(huán)素類抗生素的檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜與紫外聯(lián)用(HPLC-UV)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)及超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)等[12]。高效液相色譜(HPLC)是檢測(cè)四環(huán)素類藥物的首選方法[13]，本研究采用的是HPLC-UV法，相對(duì)于高效液相色譜與質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用或串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)聯(lián)用法靈敏度較低，檢出限較高，但成本低廉，更適合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或一般檢測(cè)分析使用。本研究建立的方法選擇Sepelco HLB小柱萃取四環(huán)素類抗生素，該柱的萃取效率較高(﹥80%)，保證了此研究方法有較好的重現(xiàn)性。四環(huán)素類抗生素通常以鹽酸鹽形式存在，在酸性溶液中較穩(wěn)定，故本研究中用濃鹽酸將水樣pH調(diào)節(jié)至2左右，流動(dòng)相中采用濃度為0.01 mo/L的草酸，提高目標(biāo)物的穩(wěn)定性。

本研究在檢測(cè)飲用水中的四環(huán)素類抗生素時(shí)僅采用定性方法，確定了檢出限，并未進(jìn)一步探究定量限，故在檢出四環(huán)素類抗生素的前提下，不能夠更進(jìn)一步明確其具體殘留量。此外，研究中飲用水的采集地為蕪湖，蕪湖處在長(zhǎng)江南岸，青弋江與長(zhǎng)江匯合處，河湖水網(wǎng)密布，雨量充沛，水系發(fā)達(dá)，也有可能是抗生素殘留濃度低未檢測(cè)出的原因，而趙騰輝等檢測(cè)東江上游水體四環(huán)素濃度達(dá)32.24 ng/L[14]。由于多數(shù)抗生素在環(huán)境中的濃度與有機(jī)物污染有關(guān)聯(lián)，同時(shí)也受水體的自凈能力和其他污染物等環(huán)境因素的制約和影響，因此在進(jìn)一步探索抗生素殘留檢測(cè)方法、開展抗生素殘留對(duì)健康危害的研究的同時(shí)，環(huán)境因素的分析也是必要的。

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