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    槲皮素對(duì)缺氧人肝癌細(xì)胞HepG2增殖及HIF-1α、VEGF的影響

    2018-03-19 06:51:22陸艷玲王榮榮馮勝進(jìn)
    武警醫(yī)學(xué) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:槲皮素低氧肝癌

    韋 艷,陸艷玲,王榮榮,馮勝進(jìn),梁 鋼

    肝細(xì)胞癌是嚴(yán)重影響人類生命健康的惡性腫瘤之一。肝癌細(xì)胞的快速增殖及耗氧量使細(xì)胞處于低氧的微環(huán)境中,低氧環(huán)境所啟動(dòng)的低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)控涉及腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移、血管生成、能量代謝等相關(guān)下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[1,2]。血管表皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α重要的靶基因之一,是促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)的重要因子,目前,研究以HIF-1α /VEGF信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物已成為熱點(diǎn),槲皮素是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物,已有大量的體內(nèi)外研究證實(shí)槲皮素可通過(guò)多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化、促進(jìn)凋亡發(fā)揮其抗腫瘤活性[3-5],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬低氧環(huán)境,測(cè)定槲皮素對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖能力、HIF-1α以及VEGF表達(dá)的影響,探討其可能的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人肝癌細(xì)胞HepG2保種于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,槲皮素(純度>99%)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司,胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司, 四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;兔抗人多克隆抗體HIF-1α、VEGF為Santa Cruz產(chǎn)品,總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa 公司,PCR 引物由上海生工公司合成,實(shí)時(shí)定量熒光PCR 檢測(cè)儀為美國(guó)Applied Biosystems公司,酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中,37 ℃,5%CO2培養(yǎng), 相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,0.25%胰酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。采用化學(xué)缺氧誘導(dǎo)劑CoCI2模擬缺氧微環(huán)境,加入培養(yǎng)液的終濃度為150 μmoI/L。

    1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 分組:正常對(duì)照組,缺氧組(化學(xué)缺氧劑CoCl2加入培養(yǎng)液的終濃度為150 μmol/L,模擬低氧微環(huán)境),缺氧+槲皮素組 (槲皮素為37.8 μmol/L,該槲皮素的濃度為48 h對(duì)細(xì)胞10%抑制率濃度)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞懸液以1×105個(gè)/ML的濃度接種于96孔培養(yǎng)

    板,每孔100 μl,培養(yǎng)12 h,加入作用藥物,每孔終體積200 μl,再分別培養(yǎng)12、24、48、72 h,終止培養(yǎng)后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 150 μl震蕩15 min,酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)492 nm處光密度值,實(shí)驗(yàn)不同日重復(fù)3次。

    1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同MTT法,各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。按trizol說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA,測(cè)定RNA純度及濃度,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物序列:β-actin正義引物5′-GCATGTACGACAGAGCCGTACGC-3′, 反義引物5′TCAACGCAGACATATCCAGC-3′長(zhǎng)度為263 bp,HIF-1α 正義引物5′-CAGTACACACAGCGTACGC-3′長(zhǎng)度為175 bp,反義引物5′TCAAGCCAGACATATGCACC-3′。VEGF正義引物5′-TGAC-TTGACTCGAGTCCTG-3′, 反義引物5′-TACGTCCT-AGCCGAGATCG-3′長(zhǎng)度為206 bp,運(yùn)用ABI PRISM7900 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序: 條件為95 ℃ 2 min(1個(gè)循環(huán)),90 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 50 s(40個(gè)循環(huán)),采用2-ΔΔCt法計(jì)算檢測(cè)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)不同日重復(fù)3次。

    1.2.4 Western Blot檢測(cè)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同MTT法,各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h。蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。定量后進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳,濕法PVDF轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉過(guò)夜,4 ℃與一抗稀釋液(1∶200)孵育過(guò)夜,TBST清洗3次,與二抗稀釋液孵育2 h, ECL發(fā)光,顯影,掃描后應(yīng)用quanity-one軟件進(jìn)行分析。

    1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用方差分析,多組資料兩兩比較采用LSD-t 多重檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 各組細(xì)胞光密度值如表1,各組細(xì)胞增殖能力如圖1,在12 h時(shí),各組細(xì)胞光密度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即各組細(xì)胞在12 h增殖能力無(wú)差異。在24、48、72 h,各組細(xì)胞光密度值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺氧組細(xì)胞增殖能力較正常對(duì)照組降低,與缺氧組比較,缺氧+槲皮素組在24、48、72 h細(xì)胞增殖能力降低。

    時(shí)間(h)正常對(duì)照組缺氧組缺氧+槲皮素組F120.369±0.0120.354±0.0130.351±0.0240.903240.640±0.0160.551±0.021①0.435±0.023②78.354481.287±0.0250.851±0.028①0.717±0.013②494.601721.738±0.0271.268±0.018①0.984±0.037②535.436

    注:與正常對(duì)照組比較, ①P<0.05, 與缺氧組比較, ②P<0.05

    圖1 各組細(xì)胞增殖能力的比較

    2.2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá) 與正常組比較,HepG2細(xì)胞在低氧狀態(tài)下HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0 05),槲皮素作用后VEGF mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0 05),對(duì)HIF-1α mRNA表達(dá)無(wú)影響,各組基因相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。

    基因正常對(duì)照組缺氧組缺氧+槲皮素組HIF-1α1.000±0.0002.298±0.031①2.326±0.027②VEGF1.000±0.0002.065±0.090①0.990±0.077③

    注:與正常組比較,①P<0.05;與缺氧組比較,②P>0.05;與缺氧組比較,③P<0.05

    2.3 Western Blot檢測(cè)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞HIF-1α 、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表3,蛋白表達(dá)區(qū)帶見(jiàn)圖2。在低氧狀態(tài)下HepG2細(xì)胞HIF-1α 、VEGF 蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05),槲皮素作用后對(duì)低氧細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)無(wú)影響,而下調(diào)VEGF 蛋白表達(dá)(P<0.05)。

    蛋白正常對(duì)照組缺氧組缺氧+槲皮素組HIF-1α0.616±0.0161.385±0.047①1.406±0.029②VEGF0.831±0.0342.022±0.076①1.137±0.054③

    注:與正常組比較,①P<0.05;與缺氧組比較,②P>0.05;與缺氧組比較,③P<0.05

    圖2 各組細(xì)胞HIF-1α 、VEGF蛋白表達(dá)區(qū)帶

    3 討 論

    HIF-1α是低氧誘導(dǎo)因子家族中受到氧濃度調(diào)節(jié)的主要因子,在缺氧情況下,HIF-1α的泛素-蛋白酶體降解途徑被阻斷導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)蓄積,從而啟動(dòng)下游因子的轉(zhuǎn)錄與翻譯。VEGF是受HIF-1α調(diào)控的下游因子之一,HIF-1α與VEGF的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合后啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄與翻譯,使其相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)增加。VEGF作為血管生長(zhǎng)重要的誘導(dǎo)因子之一,對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡等作用具有重要意義。CoCl2是較常用的低氧模型誘導(dǎo)劑,該實(shí)驗(yàn)通過(guò)CoCl2誘導(dǎo)建立肝癌細(xì)胞HepG2缺氧的微環(huán)境,HepG2細(xì)胞在CoCl2誘導(dǎo)下, HIF-1α與VEGF表達(dá)均上調(diào),達(dá)到了建立缺氧模型的目的。

    在常氧環(huán)境下,槲皮素通過(guò)多種機(jī)制對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[6,7],但是在缺氧環(huán)境中槲皮素對(duì)肝癌細(xì)胞影響的研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在低氧環(huán)境中,槲皮素可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖,并且降低細(xì)胞中高表達(dá)的VEGF。肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移依賴于其腫瘤血管生成,許多實(shí)驗(yàn)研究都呈現(xiàn)了VEGF 在肝癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)的情形。VEGF 能通過(guò)旁分泌形式特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)增加血管通透性,使血漿蛋白外滲并與其他蛋白結(jié)合形成纖維網(wǎng)絡(luò),最終形成血管化的結(jié)締組織,并且作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原,通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上Flt1和Flk1/KDR兩個(gè)特異性受體結(jié)合,直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖,誘導(dǎo)新血管生成[8]。目前已有研究表明,槲皮素可通過(guò)調(diào)控VEGF的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),有研究者通過(guò)MTT及Transwell 小室模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素體外可抑制腎癌細(xì)胞ACHN的增殖和侵襲能力,并且可下調(diào)VEGF蛋白的表達(dá),從而推測(cè)槲皮素對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響可能是其抑制ACHN增殖的機(jī)制[9]。在體外槲皮素還能抑制白血病細(xì)胞NB4生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡,同時(shí)可抑制白血病細(xì)胞分泌VEGF[10]。因此槲皮素通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)抑制腫瘤血管生長(zhǎng)可能成為其抗腫瘤的新通道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示槲皮素在低氧環(huán)境下對(duì)HIF-1α基因與蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能在低氧環(huán)境下槲皮素對(duì)肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的HIF-1α無(wú)調(diào)控作用。首先,槲皮素對(duì)低氧環(huán)境中肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過(guò)降低VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,而與HIF-1α表達(dá)無(wú)關(guān),槲皮素可能沒(méi)有通過(guò)HIF-1α /VEGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。其次,除了HIF-1α之外,VEGF還可受多個(gè)上游基因的調(diào)控,如環(huán)氧化酶(COX-2),蛋白激酶B(AktB),內(nèi)皮抑素(ES)等[11-13],槲皮素可能通過(guò)其他信號(hào)通路間接影響了VEGF的表達(dá)。最后,本次實(shí)驗(yàn)采用的槲皮素作用濃度為細(xì)胞10%抑制率濃度,可能該濃度還未足以刺激細(xì)胞中HIF-1α達(dá)到轉(zhuǎn)錄及翻譯的水平改變,致使低氧細(xì)胞中下HIF-1α mRNA 及蛋白表達(dá)無(wú)差異。

    總之,本實(shí)驗(yàn)研究觀察到了槲皮素體外低氧環(huán)境中對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖力的抑制作用,并且下調(diào)VEGF的表達(dá),可能是槲皮素抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的又一個(gè)機(jī)制。

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