貞蓮增免口服液質量標準研究

杜紅娜 ，陸 安 ，賈永兵 ，劉炳煒 ，王洪禮 ，郭永紅 ，郭永國 ，劉學杰

（1.河北普德動物藥業(yè)有限公司 050200；2.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術研究中心 050200；3.河北維爾利動物藥業(yè)集團有限公司 050200）

貞蓮增免口服液是在藥典方劑《二至丸》[1]基礎上進行組方加減，按一定工藝制備而成的口服液，由女貞子、淫羊藿、墨旱蓮等中藥配方組成，用于提高家禽家畜機體免疫力。為有效的控制產品質量本研究對貞蓮增免口服液中淫羊藿、墨旱蓮進行薄層色譜鑒別，同時采用高效液相色譜法同時測定女貞子中特女貞苷和淫羊藿中淫羊藿苷兩種有效成分的含量，方法準確可行，且專屬性強，可為其質量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀 （德國Thermo公司），DAD檢測器，變色龍工作站；AUW120D型電子天平（日本SHIMADZU公司）；101-1型電熱鼓風干燥箱（龍口市電爐制造廠）。

1.2 試劑與對照品特女貞苷對照品

（批號 111926-201605，含量 93.3%），淫羊藿苷對照品（批號 110737-200415）、旱蓮苷 A（批號 111886-201503，鑒別用）、墨旱蓮對照藥材（批號120958-201407）上述對照品及對照藥材均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；娃哈哈水。

1.3 藥材

女貞子、淫羊藿、墨旱蓮等藥材購于安國藥材市場，經本公司質控部鑒別均符合《中華人民共和國獸藥典》2015版（Ⅱ部）有關項下規(guī)定。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 淫羊藿的薄層鑒別

取貞蓮增免口服液2mL，加甲醇10mL，超聲處理30min，過濾，取濾液作為供試品溶液；取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對照品溶液；另按供試品工藝制備不含淫羊藿的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；照薄層色譜法 （2015年版藥典四部通則0502）試驗，吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上。以甲醇——丁酮——三氯甲烷——水（4：6：6：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與淫羊藿苷對照品色譜相應位置上，顯相同顏色斑點。陰性對照無干擾。結果見圖1。

圖1 淫羊藿TLC圖

2.1.2 墨旱蓮的薄層鑒別

取本品6mL，加水稀釋至25mL，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，棄去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液。另取旱蓮苷A對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。另取墨旱蓮對照藥材2g，加70%甲醇25mL超聲處理45min，放冷，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加水25mL使溶解，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20mL，棄去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，回收溶劑至干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為對照藥材溶液；另按供試品工藝制備不含墨旱蓮的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；照薄層色譜法（2015年版藥典四部通則0502）試驗，吸取對照品溶液5μL，對照藥材溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷——乙酸乙酯——甲醇——水（30：40：15：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾。結果見圖2。

圖2 墨旱蓮TLC圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈——水；流速：1.0mL·min-1；檢測波長 0～30min 為224nm，30～50min為 270nm。柱溫：35℃；進樣量：10μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品及陰性樣品溶液的制備

取本品1mL，置50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22μm微孔濾膜濾過，即得。按供試品制備工藝制備不含女貞子和淫羊藿的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備

取特女貞苷、淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含特女貞苷、淫羊藿苷各150μg的混合對照品溶液，即得。

2.2.4 專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液各10μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。對專屬性進行考察。結果表明，陰性樣品對測定無干擾，結果見圖3。

圖3 各成分HPLC色譜圖

2.2.5 線性關系考察

稱取特女貞苷和淫羊藿苷對照品各10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液適量，依次用甲醇稀釋至濃度 為 10μg·mL-1、100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1系列濃度混合對照品溶液，各精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以特女貞苷和淫羊藿苷濃度為橫坐標（X，μg·mL-1），色譜峰峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程分別為∶特女貞苷：Y＝0.1999X+0.088，（r＝1）， 淫羊藿苷：Y＝0.1624X-0.2974，（r＝0.9997）， 分別在 9.9644～249.1110μg·mL-1、10.1362～253.4050μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.6 重復性考察

取同一批樣品（批次：20180101），按取樣量 0.5：1.0：1.5 的比例分別取樣，各平行3份，按供試品溶液制備方法制備，照上述色譜條件測定，分別計算特女貞苷和淫羊藿苷的平均含量及平均含量的RSD值，考察方法的重復性。測得特女貞苷和淫羊藿苷平均含量分別為 7.59mg·mL-1和 3.25mg·mL-1，RSD 值為分別為1.08%和0.47%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 精密度考察

取同一供試品溶液，按確定的色譜條件連續(xù)進樣6次，分別記錄特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積，并分別計算峰面積的RSD值，考察方法的精密度。測得特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.33%和0.35%，表明該方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于 0，4，8，12，18，24h 進樣 1 次，分別記錄特女貞苷和淫羊藿苷峰面積，并分別計算峰面積的RSD值，考察方法的穩(wěn)定性。測得特女貞苷和淫羊藿苷色譜峰峰面積RSD值分別為0.34%和0.67%，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.2.9 準確度考察

取同一批樣品（批次：20180101）0.5mL，平行9份，分別精密加入高、中、低三個濃度的特女貞苷和淫羊藿苷混合對照品溶液，每個濃度平行3份，按確定的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果（n=9）

上述結果顯示：9份供試品溶液中，特女貞苷的回收率均介于98%～102%之間，平均回收率為100.27%，RSD值為1.45%（n＝9），該方法回收率良好。9份供試品溶液中，淫羊藿苷的回收率均介于98%～102%之間，回收率均值為99.51%，RSD值為0.76%（n＝9），表明該方法準確度符合要求。

2.2.10 系統(tǒng)耐用性試驗

a.柱溫變化對含量測定結果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在柱溫為30℃、35℃、40℃進行測定，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對照品溶液隨行對照，分別計算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較柱溫變化對測定結果的影響，結果見表3。

表3 柱溫變化對含量測定結果的影響（n=3）

由上述試驗結果可知，柱溫變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結果的RSD值均小于2%，說明柱溫的變化，對樣品含量測定結果影響較小。

b.檢測波長變化對含量測定結果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別在檢測波長222 nm，224 nm，226nm測定特女貞苷含量，在檢測波長268nm，270nm，272nm測定淫羊藿苷含量，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對照品溶液隨行對照，比較檢測波長變化對測定結果的影響，結果見表4。

表4 檢測波長變化對含量測定結果的影響（n=3）

由上述試驗結果可知，檢測波長變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結果的RSD值均小于2%，說明檢測波長的變化，對樣品含量測定結果影響較小。

c.流動相流速變化對含量測定結果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別以流速為0.8mL·min-1，1.0mL·min-1和1.2mL·min-1，進行測定，并以特女貞苷和淫羊藿苷混合對照品溶液隨行對照，分別計算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較流速變化對測定結果的影響，結果見表5。

表5 流速變化對含量測定結果的影響（n=3）

由上述試驗結果可知，流速變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結果的RSD值均小于2%，說明流速的變化，對樣品含量測定結果影響較小。

d.流動相比例變化對含量測定結果的影響 取供試品溶液，固定其他色譜條件，分別以不同比例甲醇——水為流動相，以特女貞苷和淫羊藿苷混合對照品隨行對照，分別計算特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較流動相比例變化對測定結果的影響，結果見表6。

表6 流動相比例變化對含量測定結果的影響（n=3）

由上述試驗結果可知，流動相比例變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結果的RSD值均小于2%，說明流動相比例的變化，對樣品含量測定結果影響較小。

e.不同型號色譜柱對含量測定結果的影響 按確定的方法制備供試品溶液，分別用3根不同型號色譜柱按確定的色譜條件測定特女貞苷和淫羊藿苷的含量，比較不同型號色譜柱對測定結果的影響，結果見表7。

表7 不同型號色譜柱對含量測定結果的影響（n=3）

表8 中間精密度考察結果（n=6）

由上述試驗結果可知，流動相比例變化后，特女貞苷和淫羊藿苷含量測定結果的RSD值均小于2%，說明不同型號色譜柱對樣品含量測定結果影響較小。

2.2.11 中間精密度考察

按已確定的方法，分別由不同人員在不同時間、不同儀器測定同一批次口服液中特女貞苷和淫羊藿苷的含量，每次試驗平行取樣6份，對中間精密度進行考察。結果見表8。

由上述試驗結果可知，由不同人員在不同時間、不同儀器測定同一批次樣品中特女貞苷和淫羊藿苷含量的RSD值均小于2%，表明該方法中間精密度良好。

2.3 樣品測定

取5批樣品，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下測定，計算含量。結果見表9。

表9 各成分含量測定結果（n=3）

3 結語

本研究參考藥典[1]及淫羊藿文獻［2～5］、墨旱蓮文獻［6～8］，通過TLC薄層色譜條件的摸索，分別篩選出最佳展開條件，完成淫羊藿和墨旱蓮TLC鑒別標準的制定；與此同時，對“女貞子”的鑒別也進行了考察，但初步摸索發(fā)現(xiàn)陰性樣品存在干擾，通過調整展開劑系統(tǒng)及供試品溶液制備方法［9～12］，均未得到較好的檢測結果。經查閱文獻［13］發(fā)現(xiàn)，淫羊藿中存在齊墩果酸成分，這可能是造成陰性干擾的原因。因此，女貞子的鑒別未載入質量標準，下一步科研有待深入研究。

中藥復方制劑所含成分復雜多樣，僅對其中單一成分進行檢測，不能全面反映中藥制劑的物質基礎和化學成分群的復雜性，也無法體現(xiàn)制劑整體質量情況。近年來，隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，分析技術的不斷提升，中藥復方質量評價由單一指標性成分檢測體系向多組分檢測體系發(fā)展［14］。在貞蓮增免口服液中，淫羊藿苷為淫羊藿主要有效成分，特女貞苷為女貞子中環(huán)烯醚萜類的主要活性成分，因此，本研究建立了HPLC同時測定特女貞苷和淫羊藿苷含量的高效液相色譜法。對特女貞苷、淫羊藿苷對照品進行全波長掃描時發(fā)現(xiàn)，前者在224nm有最大吸收，后者在270nm有最大吸收，同文獻［15］結果一致，故確定檢測波長為224nm和270nm，采用波長切換HPLC同時測定特女貞苷和淫羊藿苷的含量。

本研究將藥典組方“二至丸”進行組方調整制備口服液，由丸劑到口服液劑型的改變，使用更方便，便于體內消化吸收，為了確保其質量及用藥安全，通過TLC定性鑒別和HPLC定量測定來進行質量控制研究。結果表明質量控制方法準確可靠、專屬性高，可為貞蓮增免口服液制劑提供有效的質量控制方法。