CD4+CD154+T細(xì)胞亞群在中老年侵襲性真菌感染患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值

丘金浪 李玉花 黃小燕 高乾瑜 林 榮 林 虹

(福州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350001)

侵襲性真菌感染(IFI)早期癥狀和體征缺乏特異性，因此診斷往往十分困難，若未經(jīng)治療死亡率可高達(dá)100%〔1〕。在IFI的早期診斷中，使用常規(guī)的檢查方法其鏡檢的陽(yáng)性率都偏低，因此，往往利用真菌培養(yǎng)的方式以提高病原菌檢出的陽(yáng)性率，但真菌培養(yǎng)敏感性低且耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)早期的診斷也存在一定的缺陷〔2〕。近年來(lái)，包括降鈣素原(PCT)檢測(cè)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)、半乳甘露聚糖試驗(yàn)(GM試驗(yàn))、(1，3)-β-D葡聚糖實(shí)驗(yàn)(G實(shí)驗(yàn))和熒光定量PCR等快速診斷方法迅速發(fā)展，已逐漸應(yīng)用于IFI的臨床診斷。但是，以上方法均存在一定的局限性〔3〕。近期Bacher等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)真菌特異性CD4+CD154+T 細(xì)胞檢測(cè)可快速診斷IFI。本研究旨在評(píng)價(jià)CD4+CD154+T細(xì)胞診斷在中老年IFI患者的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 選取2015年5月至2017年1月在福州市中醫(yī)院呼吸科、重癥醫(yī)學(xué)科就診并確診為IFI的中老年患者共20例為IFI組，IFI的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《侵襲性肺部真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則(草案)》〔5〕。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合IFI診斷標(biāo)準(zhǔn)，并由主治醫(yī)生確診為IFI的中老年患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)正在血液透析患者；(2)使用某些如多粘菌素E、厄他培南、頭孢噻肟和磺胺類藥物的患者；(3)食用香菇多糖的患者；(4)哺乳期或孕期婦女；(5)合并真菌和細(xì)菌感染患者。細(xì)菌感染但無(wú)真菌感染患者納入細(xì)菌組20例；既無(wú)真菌感染，也無(wú)細(xì)菌感染者納入健康組20例。其中IFI組患者年齡45～99歲，平均(68.6±17.7)歲；細(xì)菌組年齡46～94歲，平均(73.30±17.78)歲；正常組年齡46～96歲，平均(70.90±16.94)歲。各組男女比例均為1∶1。各組間年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀BD Accuri C6購(gòu)自美國(guó)BD公司；血常規(guī)分析儀XN-1000購(gòu)自日本希森美康公司；MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自北京金山川科技發(fā)展有限公司；艾瑞德快速免疫分析儀為日本株式會(huì)社常光公司產(chǎn)品；梅里埃BACT/ALERT3D60全自動(dòng)血培養(yǎng)分析儀。

1.3試劑 PE-anti CD154、APC-Cy7-anti CD4、FITC-anti CD3熒光抗體均購(gòu)自Biolgend 公司；真菌BG檢測(cè)采用GKT-5M動(dòng)態(tài)真菌檢測(cè)試劑盒(光度法)，購(gòu)于北京金山川科技發(fā)展有限公司；PCT檢測(cè)試劑盒和CRP檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于日本株式會(huì)社常光公司；XN-1000血常規(guī)分析儀檢測(cè)試劑購(gòu)于日本希森美康公司；血培養(yǎng)瓶購(gòu)于梅里埃公司。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1血常規(guī)檢測(cè) 采集患者靜脈全血，按照希森美康XN1000儀器操作說(shuō)明進(jìn)行操作檢測(cè)。WBC參考值：(5～10)×109/L。

1.4.2血清(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè) 采用無(wú)熱源BD專用采血管采集患者外周靜脈血。3 000 r/min離心10～15 min，靜置，取上清液待檢。采用北京金山川科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的GKT-1M真菌及配套的T01智能恒溫儀、水浴槽。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)操作。判斷標(biāo)準(zhǔn)：0～60 pg/ml陰性；61～100 pg/ml灰區(qū)；≥100 pg/ml 陽(yáng)性。

1.4.3CRP和PCT檢測(cè) 分別采集患者靜脈全血，按照艾瑞德快速免疫分析儀操作說(shuō)明進(jìn)行操作檢測(cè)。CRP參考值0～10 ng/ml，PCT參考值0～0.5 ng/ml。

1.4.4CD4+CD154+T細(xì)胞檢測(cè) 采集患者靜脈血，EDTA-2K抗凝，以PE-anti CD154、APC-Cy7-anti CD4、FITC-anti CD3熒光抗體孵育30 min，流式細(xì)胞檢測(cè)CD4+CD154+T細(xì)胞水平。

1.5觀察指標(biāo) 觀察三組CD4+CD154+T細(xì)胞水平、(1，3)-β-D葡聚糖水平、CRP水平、PCT水平和WBC水平，并用ROC曲線和曲線下面積(AUC)分析CD4+CD154+T細(xì)胞亞群診斷IFI的敏感性和特異性。

2 結(jié) 果

2.1IFI組、細(xì)菌組和健康組各指標(biāo)比較 三組之間WBC水平比較：細(xì)菌組>IFI組>健康組，兩兩之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PCT水平比較：細(xì)菌組>IFI組和健康組，IFI組與健康組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)菌組與其余兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CRP水平比較：IFI組和細(xì)菌組>健康組，IFI組與細(xì)菌組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，健康組與其余兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(1，3)-β-D葡聚糖水平比較：IFI組>細(xì)菌組和健康組，IFI組與其余兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)菌組和健康組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CD4+CD154+T細(xì)胞水平比較：IFI組>細(xì)菌組和健康組，IFI組與其余兩組之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)菌組和健康組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 IFI組、細(xì)菌組和健康組各指標(biāo)比較

與細(xì)菌組比較：1)P<0.05；與正常組比較：2)P<0.05

2.2受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估各指標(biāo)診斷IFI 對(duì)IFI組、細(xì)菌組和健康組WBC、PCT、CRP、(1，3)-β-D葡聚糖和CD4+CD154+T細(xì)胞等指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析結(jié)果，見表2。ROC曲線見圖1。通過(guò)ROC曲線分析顯示(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè)真菌感染時(shí)診斷效能最高，AUC為0.980，在所有檢測(cè)方法中最大，敏感性及特異性分別為95.00%和93.00%，而CD4+CD154+T細(xì)胞次之，AUC為0.837，敏感性及特異性分別為81.00%和82.00%。

表2 各項(xiàng)指標(biāo) ROC曲線比較分析

圖1 各項(xiàng)指標(biāo)ROC曲線

3 討 論

IFI是指真菌在人體組織、血液中生長(zhǎng)繁殖，從而引起其器官功能障礙、組織損害及炎癥反應(yīng)等病理生理發(fā)生改變的過(guò)程〔6〕。近年來(lái)，隨著大劑量廣譜抗生素的應(yīng)用、骨髓器官移植的開展、抗腫瘤藥物和糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的應(yīng)用，導(dǎo)致像念珠菌血癥和系統(tǒng)性曲霉病等深部真菌感染的發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢(shì)〔7〕。IFI主要包括ICU真菌感染、器官移植真菌感染、獲得性免疫缺陷綜合征真菌感染，據(jù)統(tǒng)計(jì)，三者發(fā)病率分別為8%～15%、20%～40%、90%〔8，9〕。引起IFI的病原體可分為兩類：一類為真菌致病菌，另一類為細(xì)菌致病菌，真菌致病菌主要包括組織胞質(zhì)菌和球孢子菌，可在正常宿主和免疫功能低下患者中引起疾?。患?xì)菌致病菌主要包括念珠菌和曲霉，一般多侵犯免疫功能受損的宿主〔10〕。IFI快速診斷是降低真菌感染病死率的有效途徑〔11〕。由于IFI診斷缺乏特異性，臨床上對(duì)其的檢測(cè)無(wú)靈敏、簡(jiǎn)單的方法，因此一般容易造成誤診、漏診。近年來(lái)，PCT、CRP、GM試驗(yàn)、G實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR等均被用于IFI的快速診斷，但均存在一定的缺陷。PCT屬于非類固醇抗炎物質(zhì)，多產(chǎn)生于細(xì)菌感染，其可作為診斷細(xì)菌感染與病毒感染的一項(xiàng)敏感性指標(biāo)，也常用于預(yù)警膿毒癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征等疾病〔12〕。CRP是重要的免疫反應(yīng)因子，其一般在感染或其他炎癥過(guò)程中由肝臟合成。但是，PCT和CRP檢測(cè)均只能診斷細(xì)菌性感染，無(wú)法辨別是否為真菌感染。(1，3)-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的組成成分，其廣泛分布于曲霉菌、組織胞質(zhì)菌、念珠菌等的細(xì)胞壁中。(1，3)-β-D葡聚糖在淺部真菌感染時(shí)不會(huì)被釋放，因此，GM試驗(yàn)可用于輔助診斷深部真菌感染；GM試驗(yàn)也是當(dāng)前已經(jīng)確證用于檢測(cè)曲霉菌的方法，但其檢測(cè)結(jié)果往往易受某些食物或藥物的影響。G試驗(yàn)屬于廣譜的真菌檢查，具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但其無(wú)法區(qū)分真菌種類，在污染、血液透析、使用某些如多粘菌素E、厄他培南、頭孢噻肟和磺胺類藥物或者食用香菇多糖的患者均可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此一般需與其他檢測(cè)方法聯(lián)合使用〔13〕。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)患者創(chuàng)傷小，而且取材方便，其可檢測(cè)出組織中真菌的脫氧核苷酸，并可以定量檢測(cè)有無(wú)真菌感染以及種屬，但是耗時(shí)長(zhǎng)且成本較高。CD4+CD154+T細(xì)胞是機(jī)體抗感染過(guò)程中免疫反應(yīng)的重要活化細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體受到細(xì)菌感染是，細(xì)胞中CD4+CD154+T的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，其通過(guò)對(duì)機(jī)體非特異性B細(xì)胞進(jìn)行活化引起一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究結(jié)果也表明其在IFI患者中表達(dá)水平也是存在明顯差異，因此可作為診斷IFI的指標(biāo)〔14〕。由于本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按照G試驗(yàn)檢測(cè)要求，避免了患者在檢測(cè)過(guò)程中受到各干擾因素影響，因此在研究中(1，3)-β-D葡聚糖水平檢測(cè)的準(zhǔn)確性才能達(dá)到較理想的水平，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中(1，3)-β-D葡聚糖水平檢測(cè)往往容易受到各種干擾因素影響從而降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。CD4+CD154+T細(xì)胞在診斷IFI的敏感性和特異性分別為81.00%和82.00%，說(shuō)明CD4+CD154+T細(xì)胞對(duì)中老年IFI患者的診斷相比其他常用方法具有一定的優(yōu)勢(shì)，可作為有效的檢測(cè)方法之一。

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