婦產(chǎn)科?？粕飿颖編斓慕ㄔO(shè)和管理

李 倩，金莉萍

生物樣本庫也叫生物銀行，主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲存和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細(xì)胞、組織和器官等樣本以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、檢驗、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用系統(tǒng)[1]。生物樣本庫的主要優(yōu)勢是快速高效地訪問集合的人類生物材料和相關(guān)的臨床信息。這些收集和保存完好的資源能節(jié)約重大研究成果的時間從而提高研究的競爭力，并加速推動科學(xué)進步[2]。

作為一家三級甲等婦產(chǎn)科專科醫(yī)院，上海市第一婦嬰保健院擁有豐富的婦科和產(chǎn)科疾病資源。為了收集及整合各臨床科室分散的臨床疾病資源，我院于2014年底開始籌建面對全院各臨床科室的生物樣本庫。主要職能是標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量地采集、處理、儲存和利用組織、血液、體液等婦產(chǎn)科臨床疾病資源，為婦產(chǎn)科相關(guān)疾病的臨床研究提供科研材料。高質(zhì)量的保存臨床樣本，形成樣本庫動態(tài)存儲和使用的模式，促進臨床樣本資源對醫(yī)院臨床研究和基礎(chǔ)科研的支持，帶動臨床、科研和教學(xué)工作[3]。

目前我院已建成分區(qū)明確、布局合理、功能齊全的規(guī)范化樣本庫場地。收集范圍包括產(chǎn)科、婦科、乳腺腫瘤、出生缺陷、習(xí)慣性流產(chǎn)等方面的標(biāo)本。樣本庫的職能包括腫瘤組織和血液、臍帶血、胎盤、絨毛、胸腹水、羊水等標(biāo)本的前處理；核酸蛋白提取純化和質(zhì)量控制；病理蠟塊和切片的制備和質(zhì)控；組織芯片的制備等。建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的樣本采集、處理和儲存操作流程和質(zhì)量管理體系。作者主要介紹在婦產(chǎn)科?？粕飿颖編旖⑦^程中所積累的經(jīng)驗和遇到的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 場地 生物樣本庫位于門診樓三樓，設(shè)有分區(qū)和功能明確的獨立專屬場地，按功能分為樣本接收間、樣本處理實驗室、RNA實驗室、細(xì)胞實驗室、超低溫冰箱間、液氮儲存間等功能區(qū)，其中樣本接收間主要用于臨床標(biāo)本的接收和暫存、樣本信息資料錄入等，樣本處理實驗室能完成對樣本的初步處理(如離心、分裝等)，根據(jù)特殊樣本處理需求亦可在樣本處理實驗室、細(xì)胞實驗室、RNA實驗室完成對樣本的深度加工(如核酸與蛋白的提取、細(xì)胞的培養(yǎng)與保存等)，樣本存儲區(qū)(超低溫冰箱間和液氮儲存間)的儲存規(guī)?？蛇_百萬份(圖1)。

圖1 生物樣本庫功能分區(qū)布局示意圖

1.1.2 設(shè)備和試劑耗材

1.1.2.1 樣本處理和儲存設(shè)備 生物安全柜(美國Thermo公司)、臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、血液離心機(德國Sigma公司)、低溫標(biāo)簽打印套裝(美國Brady公司)、移液器套裝(德國Eppendorf公司)、高壓滅菌鍋(日本三洋公司)、制冰機(日本三洋公司)、核酸提取純化系統(tǒng)(北京百泰克公司)；樣本質(zhì)控設(shè)備：Nanodrop one紫外分光光度計(美國Thermo公司)、生物分析儀(美國安捷倫公司)；樣本儲存設(shè)備：超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司)、溫濕度監(jiān)控系統(tǒng)(青島海爾特種電器有限公司)、氣相液氮罐(美國MVE公司)。

1.1.2.2 試劑耗材 真空采血管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、無菌注射器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)、凍存管(上海萬格科學(xué)器材有限公司)、凍存盒(上海萬格科學(xué)器材有限公司)、RNAlater保存液(美國Ambion公司)、核酸提取試劑盒(北京百泰克公司)、蛋白定量試劑盒(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織建設(shè)和人員培訓(xùn) 參照國內(nèi)較成熟樣本庫的建設(shè)模式，結(jié)合醫(yī)院自身特點，樣本庫組織架構(gòu)由5部分組成：管理委員會、學(xué)術(shù)委員會、倫理委員會、生物安全評審委員會、執(zhí)行機構(gòu)。在此基礎(chǔ)上安排專人分別負(fù)責(zé)樣本的采集和前處理、核酸蛋白提取和質(zhì)量管理、樣本信息數(shù)據(jù)管理、樣本出入庫和常務(wù)管理等，并按照崗位職責(zé)的不同給予相應(yīng)的培訓(xùn)內(nèi)容、方式、要求和頻率，定期參加生物樣本庫標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)會議[4]。

1.2.2 知情同意書的簽署 樣本庫的建立和知情同意書的內(nèi)容均經(jīng)過院倫理委員會審查，嚴(yán)格保護患者隱私和權(quán)益[5]。樣本庫收集標(biāo)本必須先征得患者的知情同意，主要是同意收集其血液樣本、手術(shù)切除的組織樣本或分娩后的胎盤附屬物等以及相關(guān)臨床診療信息用于科學(xué)研究。為方便和患者溝通，簽署知情同意書主要由經(jīng)治醫(yī)生在術(shù)前談話時完成。

1.2.3 血液標(biāo)本的采集和處理 術(shù)前血采集由病房護士完成，臍帶血由樣本庫人員在剖宮產(chǎn)術(shù)中抽取，抗凝血樣(乙二胺四乙酸抗凝管)和非抗凝血樣(無添加劑)各采集1管，每管5 mL；經(jīng)1 600 g離心15 min后分離血清、血漿、血凝塊，并通過淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核淋巴細(xì)胞后分別裝入凍存管并保存在-80 ℃冰箱中，整個過程要求在2 h內(nèi)完成。

1.2.4 組織樣本的采集和處理 組織樣本的采集在手術(shù)室標(biāo)本離體后進行，婦科標(biāo)本取腫瘤、癌旁和正常組織，產(chǎn)科標(biāo)本取胎盤、臍帶、胎膜組織，采集并分裝完成后立即置于液氮中速凍或放入RNAlater保存液中保存。為保證組織標(biāo)本的質(zhì)量，從組織離體到組織凍存的時間最長不超過30 min[6](圖2)。

注：N代表正常組織；P代表癌旁組織；T代表癌癥組織圖2 婦科腫瘤組織樣本的處理流程

1.2.5 樣本接收和入庫管理 工作人員在接收樣本前核對樣本、知情同意書和樣本采集登記表，確認(rèn)無資料缺失、信息不符、樣本泄露或質(zhì)量問題后方能接收。將樣本信息錄入樣本庫管理系統(tǒng)后，系統(tǒng)根據(jù)樣本庫定義的規(guī)則輔助生成樣本編號并自動生成二維條形碼，自動為多個樣本復(fù)份分配儲存位置，完成樣本的入庫。

1.2.6 樣本資源的使用和出庫 為規(guī)范樣本庫標(biāo)本的申請和使用，合理、有效地發(fā)揮資源優(yōu)勢，督促樣本的使用和產(chǎn)出，院內(nèi)外申請者使用樣本前，必須填寫樣本申請表，并經(jīng)過院倫理委員會、科教科等審核通過后樣本方能出庫。樣本出庫前，樣本管理人員在管理系統(tǒng)中按條件篩選出符合申請者要求的樣本，選擇出庫并打印出庫單，按照出庫單上的樣本儲存位置在相應(yīng)冰箱/液氮罐中取出樣本，復(fù)核無誤后完成樣本的交接。

2 結(jié)果

2.1 樣本和信息收集情況

2.1.1 樣本收集情況 樣本庫建設(shè)之初，主要以收集婦科各類惡性腫瘤的組織和血液標(biāo)本為主。隨著樣本庫場地的擴大和各類軟硬件設(shè)施的完善，醫(yī)院內(nèi)部各個科室對樣本庫作用和地位日益重視，各科室積極主動地配合各類有研究意義病種的樣本收集和保存工作。在此基礎(chǔ)上我們分別建立了針對醫(yī)院各個科室的不同類樣本的收集和保存流程。目前樣本庫的收集范圍涵蓋了婦科、產(chǎn)科、生殖免疫科、輔助生殖科、新生兒科、兒童保健科等科室的多個病種?，F(xiàn)已庫存29個病種70 000余份樣本，所有樣本在收集前患者均簽署了知情同意書(圖3)。

圖3 生物樣本庫歷年樣本總數(shù)和病種數(shù)統(tǒng)計

2.1.2 樣本信息收集情況 樣本庫采用朗珈樣本庫管理系統(tǒng)，通過醫(yī)院信息科，實現(xiàn)了樣本庫管理軟件與住院醫(yī)生工作站、病理系統(tǒng)、檢驗系統(tǒng)、手麻系統(tǒng)、影像系統(tǒng)等的對接，可將患者的基本信息以及相關(guān)診療信息自動導(dǎo)入樣本庫管理軟件。臨床隨訪信息的采集和登記由專人管理，樣本庫定期收集樣本隨訪信息并將其錄入樣本庫管理系統(tǒng)。

2.2 樣本的質(zhì)量控制 獲取高質(zhì)量的樣本和相關(guān)臨床資料對于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究至關(guān)重要。為了保證樣本的質(zhì)量，樣本庫參照國外的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)指南[7-10]，建立了一套符合婦產(chǎn)科疾病特色的樣本庫質(zhì)量管理體系文件，規(guī)定了對不同類型標(biāo)本的質(zhì)控流程和標(biāo)準(zhǔn)以及樣本的抽檢方案。根據(jù)病種類型、樣本類型、儲存方式的不同，采用隨機抽取的原則，每月對新入庫腫瘤組織標(biāo)本100%進行形態(tài)學(xué)檢測，隨機抽取5%的新入庫樣本進行分子質(zhì)量檢測，隨機抽取10%的新入庫樣本進行信息核對。

2.2.1 組織形態(tài)學(xué)質(zhì)量檢測 主要針對婦科腫瘤組織做形態(tài)學(xué)質(zhì)控，對樣本進行病理形態(tài)學(xué)評估，在鏡下觀察腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)信息，包括腫瘤成分比例、是否有組織壞死、是否有淋巴細(xì)胞浸潤等[11]。對于冷凍組織樣本，在手術(shù)室取材時，單獨留取一塊組織速凍，取材完成后制作冷凍組織切片，染色后鏡下進行病理形態(tài)學(xué)質(zhì)控。對于石蠟組織樣本，在常規(guī)石蠟取材時，單獨留取一塊組織，制作石蠟組織切片，蘇木精-伊紅染色后進行病理形態(tài)學(xué)質(zhì)控。鏡檢下腫瘤成分比例在60%以上視為腫瘤取樣合格。

2.2.2 分子學(xué)質(zhì)量檢測 主要從樣本中提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)，檢測其濃度、純度和完整性[12]。核酸提取用全自動核酸提取儀，自動化提取樣本中的DNA/RNA，然后用超微量分光光度計檢測DNA/RNA的濃度和純度，用生物分析儀檢測DNA/RNA的完整性。采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法人工提取組織中的蛋白質(zhì)，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度和總量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測蛋白。從樣本庫的組織樣品中提取的蛋白質(zhì)濃度均大于1 μg/μL，總量均大于100 μg，蛋白條帶分明，未發(fā)生明顯降解(圖4)，可滿足后續(xù)科研應(yīng)用。

圖4 蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

2.2.3 樣本信息質(zhì)控 對樣本信息進行隨機抽檢，每個月從新入庫的樣本中抽取10%進行樣本相關(guān)信息和位置核對，主要檢查樣本相關(guān)臨床信息是否正確和完整、是否有隨訪信息、樣本條碼是否正確、實體庫與虛擬庫的位置是否一一對應(yīng)，相關(guān)樣本記錄是否完整。經(jīng)隨機抽檢和核對，95%以上樣本信息完整，約99%的樣本位置信息正確。

2.3 樣本庫取得的科研成效 樣本庫出庫的樣本和信息支持了我院國家自然科學(xué)基金、上海市科委、上海市衛(wèi)計委、同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院等各個級別科研課題的立項。以2016年為例，生物樣本庫共支持了6項國家自然科學(xué)基金資助課題的研究。樣本庫的出庫量約占同時期樣本入庫量的8%。同時，生物樣本庫已獲得關(guān)于樣本取材、轉(zhuǎn)運和保存方面的3項專利授權(quán)。

3 討論

3.1 建設(shè)婦產(chǎn)科?？粕飿颖編斓囊饬x 目前女性生殖系統(tǒng)很多疾病發(fā)病機制不明，缺乏大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，診治困難，缺乏診治規(guī)范，亞學(xué)科亟待發(fā)展。尤其是乳腺腫瘤和婦科腫瘤是嚴(yán)重危及人類生命的疾病之一，多年來一直是臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域最受關(guān)注的問題。研究婦科腫瘤生物學(xué)特性、臨床治療的有效性、防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是亟待解決的難題。生物樣本庫可以為相關(guān)研究提供病變和正常對照標(biāo)本以及相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)?？蒲腥藛T可通過對海量數(shù)據(jù)的研究，獲知疾病的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)新的疾病診斷和治療標(biāo)志物，從而發(fā)現(xiàn)新的疾病干預(yù)、檢測和治療方式。生物樣本庫在婦產(chǎn)科臨床和基礎(chǔ)研究中的作用越來越被人們所重視。

3.2 規(guī)范樣本收集流程，保證樣本來源是生物樣本庫運行的難點 由于樣本收集范圍涉及到全院各臨床科室，樣本的采集工作需要臨床醫(yī)護人員配合。由于臨床醫(yī)護人員不熟悉樣本收集流程和操作規(guī)范，常造成知情同意書的簽署不規(guī)范、樣本漏收、樣本延遲運送造成的質(zhì)量問題等。經(jīng)過與臨床相關(guān)人員的溝通，不斷完善和規(guī)范臨床樣本收集流程，使之更好地適應(yīng)臨床現(xiàn)有流程，如婦科腫瘤患者的血液采集可安排在術(shù)前一天和檢驗科抽血一起進行，以減少患者痛苦。通過幾次集中地針對全院臨床醫(yī)護人員的樣本收集流程和操作規(guī)范培訓(xùn)，樣本的臨床采集流程問題得到了解決，知情同意書的簽署、臨床樣本的收集、樣本的運送流程得到了很好地銜接。

與其他腫瘤相比，婦科腫瘤病理類型多、病灶小且不明顯，因此存在各類樣本取材不規(guī)范的問題，直接影響了所收集樣本的質(zhì)量。特別對于腫瘤組織樣本，取材的準(zhǔn)確性直接影響了科研結(jié)果的可靠性[13]。而對于產(chǎn)科標(biāo)本，如羊水、胎盤、絨毛等類型標(biāo)本的收集，由于缺乏收集經(jīng)驗，故需查閱相關(guān)文獻，并同產(chǎn)科相關(guān)科研人員溝通確定樣本收集的目標(biāo)和以后的應(yīng)用方向，確定樣本收集和前處理、保存方式。建立各類樣本的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，對樣本從取材、運輸、處理到保存的每個步驟均有標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)定，以保證樣本在采集及儲存期間能夠保持其生物學(xué)穩(wěn)定性，可用于進一步實驗研究[14]。對于婦科腫瘤組織樣本，取材人員需通過我院病理科為期3個月的婦科腫瘤取材培訓(xùn)，通過后方能上崗，以保證組織取材的準(zhǔn)確性。

3.3 樣本庫持續(xù)有效運營亟需解決的問題 目前我院生物樣本庫建設(shè)的資金主要來源于醫(yī)院自籌資金，服務(wù)對象主要是醫(yī)院內(nèi)部的研究人員。而樣本庫的長期穩(wěn)定運行需要充足可靠的資金來保障。樣本庫進入慣性運營階段后，對外開放服務(wù)收費可作為日常管理費用的有效補充[15]。因此，建立樣本庫對外開放合作和收費機制，對樣本庫可持續(xù)發(fā)展和運營具有積極意義。遺憾的是，在樣本庫對外共享和收費模式方面，目前國內(nèi)并沒有可借鑒的條例和規(guī)范。現(xiàn)狀是醫(yī)院外的研究者較難獲得醫(yī)院生物樣本庫的資源，共享機制尚未完善[16]，衛(wèi)生行政管理部門對生物樣本庫的監(jiān)管缺失。為此，建議我國應(yīng)通過政府相關(guān)部門盡快制定相關(guān)運營和管理規(guī)范，加強生物樣本庫的管理規(guī)范制定和運行監(jiān)管，促進生物樣本庫科學(xué)、有序發(fā)展，使生物樣本的有限投入發(fā)揮更大作用。

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