魯晉秀 ,閆秋艷 ,李 倩 ,聶園軍 ,楊 峰
(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所,山西臨汾041000;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所,山西太原030006)
植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lipid transfer protein,LTP)是一類可溶性的小分子蛋白,因其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)脂類物質(zhì)而得名。LTP蛋白N端有一個包含21~29個氨基酸的信號肽,能夠引導(dǎo)蛋白分泌到細(xì)胞外參與細(xì)胞外親脂性物質(zhì)(如角質(zhì))的沉積途徑[1]。LTP蛋白含有8個半胱氨酸殘基(C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXCXn-C-Xn-C),可以形成4個二硫鍵[2]。體外試驗(yàn)表明,這4個二硫鍵形成一個疏水腔,因而能夠結(jié)合脂類和一些疏水性物質(zhì)[3]。不同物種的LTP蛋白一級結(jié)構(gòu)差異較大,根據(jù)其分子量大小最初將其分為LTP I和LTP II共2個亞家族,其中,LTP I分子質(zhì)量大約為10 ku,由90~95個氨基酸殘基組成;LTP II分子質(zhì)量大約為7 ku,由70個氨基酸組成。2個亞家族都含有保守的8個半光氨基酸殘基,其形成二硫鍵的配對方式不同:LTP I家族中半胱氨酸殘基配對組合為 1-6,2-3,4-7 和 5-8,LTP II家族中半胱氨酸殘基配對組合為1-5,2-3,4-7和6-8。后來在玉米中發(fā)現(xiàn)了花藥特異性轉(zhuǎn)錄基因MZm3-3,該基因表達(dá)的蛋白與nsLTPs同源,被認(rèn)為是TypeIII[4]。BOUTROT等[5]通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將水稻和擬南芥的nsLTPs分為9種類型(type),不同類型可以通過8個半胱氨酸之間的氨基酸數(shù)目來區(qū)分。
植物L(fēng)TP首次從菠菜葉中分離[6],隨后其他不同植物L(fēng)TP成員也相繼被報(bào)道。目前,已經(jīng)從多種植物中分離到LTPs基因,在小麥中鑒定出23個LTP基因[7],在棉花中已分離到11個LTP基因[8],在擬南芥中分離到15個LTP基因[9],而近來對水稻全基因組序列的分析發(fā)現(xiàn),在水稻中存在52個脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[5]。
脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類小分子蛋白家族,其細(xì)胞定位也比較復(fù)雜,免疫定位研究表明,AtLTP1存在于細(xì)胞壁中[10],在玉米胚芽鞘的表皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有LTP的存在[11]。
通過Northern blot實(shí)驗(yàn)、原位雜交以及對轉(zhuǎn)基因植物中LTP-GUS融合蛋白的GUS活性檢測等技術(shù),對LTP的表達(dá)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)不同植物L(fēng)TP在時間和空間上表現(xiàn)出復(fù)雜的表達(dá)模式,同一植物的不同LTP可能有其特有的表達(dá)模式。在大麥中發(fā)現(xiàn)的2個幼苗特異性表達(dá)LTP基因,一個在幼苗葉片中的表達(dá)量要高于胚芽鞘,而另一個表達(dá)恰好相反[12]。蓖麻中l(wèi)tpC1和ltpC2在子葉中表達(dá),而ltpD則在胚軸中表達(dá)[13]。通過研究發(fā)現(xiàn),LTP主要存在于植物的地上部分,如植物的葉、莖和芽的分生組織中,但在根中沒有檢測到LTP基因的表達(dá)[6,14-15]。
有研究在青花菜中發(fā)現(xiàn),LTP與葉片中角質(zhì)層蠟質(zhì)合成有關(guān),免疫分析發(fā)現(xiàn)其蛋白的50%在幼葉中表達(dá),隨著葉片的老化蛋白含量降低至4%,上述結(jié)果表明,LTP和轉(zhuǎn)運(yùn)角質(zhì)單體以及角質(zhì)合成有關(guān)[16]。對AtLTP1基因的研究也表明,其在正在發(fā)育的幼嫩組織中的表達(dá)量要高于成熟的組織[17],在胡蘿卜的胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EP2基因?qū)儆贚TP家族,該基因在胚細(xì)胞、莖尖、發(fā)育的花以及成熟種子的種皮和果皮中表達(dá),有運(yùn)輸角質(zhì)單體的功能,這對形成胚的脂質(zhì)層是非常必要的[18]。
在植物花和花器官中也檢測到有LTP基因的表達(dá),比如LTP基因在擬南芥正在發(fā)育的花序中有較高的轉(zhuǎn)錄水平,研究還發(fā)現(xiàn),在煙草的萼片[14]、花椰菜的花蕾[15]以及油菜籽的小孢子[19]中都有LTP基因的表達(dá)。
1.3.1 角質(zhì)層蠟質(zhì)合成和胚胎發(fā)育 由于信號肽的存在,使得蛋白能夠分泌到細(xì)胞外參與親脂性物質(zhì)比如角質(zhì)的沉積,LTP蛋白能夠結(jié)合?;渾误w,這在角質(zhì)合成過程中起到重要作用[1]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTPG參與角質(zhì)的合成,該基因突變導(dǎo)致莖表皮細(xì)胞角質(zhì)層蠟質(zhì)組成發(fā)生變化以及蠟質(zhì)積累減少[20]。煙草中LTP基因表達(dá)量上升,從而使葉片的角質(zhì)層蠟質(zhì)積累增加[21]。上述結(jié)果均表明,LTP參與植物角質(zhì)層蠟質(zhì)運(yùn)輸和積累。研究發(fā)現(xiàn),LTP在幼胚中有很高的表達(dá)量,推測LTP可能在胚胎發(fā)育早期保護(hù)層形成中起到重要作用[18]。1.3.2 生殖器官發(fā)育 ARIIZUMI[22]在花粉發(fā)育階段的絨氈層細(xì)胞檢測到擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtLTP12基因的表達(dá),認(rèn)為該基因能夠在花粉發(fā)育過程中從絨氈層向花粉外壁傳遞脂質(zhì)。水稻OsC6編碼一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,在絨氈層細(xì)胞中有很高的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn),RNAi干擾OsC6基因表達(dá),轉(zhuǎn)基因水稻的花藥細(xì)胞表現(xiàn)出絨氈層不能降解,從而降低了花粉的育性[23]。
1.3.3 病原菌的防御 LTPS蛋白與植物抗病相關(guān),在受到病原菌誘導(dǎo)時基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升,其蛋白能使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[24]。例如,從大麥葉片中得到的純化LTP-like蛋白以及從玉米中分離出的LTP對細(xì)菌性病原體和真菌生長起到了抑制作用。在煙草中過表達(dá)小麥ltp3F1,能夠提高煙草對真菌病害的抗性。SUN等[25]研究認(rèn)為,LTP能夠結(jié)合磷脂使真菌病原體的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變。MALDONADO等[26]通過篩選一系列擬南芥突變體是否產(chǎn)生SAR特異應(yīng)答時,得到了1個對假單胞菌有局部抗性的缺陷型誘導(dǎo)抗性基因dir1-1,其中,dir1-1編碼LTP,因此,推測DIR1能夠和脂類物質(zhì)相互作用,促進(jìn)信號遠(yuǎn)距離傳導(dǎo),進(jìn)而表現(xiàn)為對病原體的抗性。但在近期的研究中發(fā)現(xiàn),擬南芥中AtLTP3能夠增加體內(nèi)ABA的合成,從而提高植株對病原菌的易感性[27]。
1.3.4 抗非生物脅迫 已有研究證明,LTP與植物防御反應(yīng)激發(fā)子elicitin[28]在結(jié)構(gòu)和功能特性上有些類似,能夠與植物控制防御反應(yīng)的受體相結(jié)合,因此可推測脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物受到脅迫反應(yīng)的早期即發(fā)揮作用。作為一種防御蛋白,LTP基因的表達(dá)量常受到干旱、鹽脅迫等處理的影響。比如,芝麻SiLTP2與SiLTP4基因的表達(dá)受NaCl、甘露醇等脅迫的誘導(dǎo)[29]。擬南芥中過表達(dá)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AZI1株系的耐鹽性明顯高于野生型和突變體株系[30]。干旱處理后的雀麥草LTP基因在復(fù)水3 d后表達(dá)量加倍[31]。過表達(dá)辣椒CALTP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽和抗旱性能比野生型顯著提高[32]。
LTP作為小分子家族,在基因序列上保守,其基因表達(dá)上卻表現(xiàn)各異,例如JANG等[33]在小麥-黑麥易位系2BS/2RL中克隆到2個LTP家族基因LTP1和LTP2,Northern blot分析表明,在植株的葉片、莖和花冠中表達(dá),原位雜交進(jìn)一步表明,LTP1和LTP2在葉片細(xì)胞的維管束和花冠細(xì)胞的維管束組織層中表達(dá)。BOUTROT等[7]用GUS作為報(bào)告基因,同樣在轉(zhuǎn)基因水稻根、葉和花的維管組織中檢測到6個小麥LTP基因啟動子活性,進(jìn)一步說明,LTP在維管組織中發(fā)揮一定作用。YU等[34]從小麥3B,3D和5D染色體上分離出3個I類型的LTP基因,研究表明,這3個基因在轉(zhuǎn)基因煙草的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),同時還發(fā)現(xiàn),TaLTPId.1在葉綠體中也有少量表達(dá)。
LTP家族蛋白長期以來被歸類為PR(pathogenesis-related)家族的成員,因此,其在植物防御病原菌方面發(fā)揮一定作用[35]。例如SUN等[25]從小麥中克隆了9個ns-LTP基因的cDNA,研究發(fā)現(xiàn),它們在體外能夠抑制致病病原菌的生長;過表達(dá)TaLTP5基因的轉(zhuǎn)基因小麥對赤霉病和根腐病具有一定的抗性[36]。過表達(dá)小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TdLTP4的擬南芥對真菌抗性有顯著提高[37]。目前有研究表明,并不是所有家族成員均有抗病性作用,如TaDIR1-2基因,與擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtDIR1同源,通過基因沉默的方法敲除小麥中TaDIR1-2基因,結(jié)果顯示,該轉(zhuǎn)基因小麥對條銹病的抗性顯著增加,表明TaDIR1-2基因通過改變ROS或者水楊酸信號途徑對抗病性起到負(fù)調(diào)控作用[38]。
LTP作為一種防御蛋白,在小麥中同樣被檢測到在植株抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮一定作用。JANG 等[33,39]通過 Northern blot分析表明,LTP1 和LTP2基因在ABA和冷脅迫處理植株24 h后表達(dá)量升高,干旱處理3 d后表達(dá)量升高。原位雜交試驗(yàn)進(jìn)一步表明,在植株花冠細(xì)胞的維管束組織層中干旱處理植株的基因表達(dá)量高于對照植株,認(rèn)為由于植株缺水導(dǎo)致維管束組織層被破壞,而LTP基因此時表達(dá)量升高,從而推測在干旱脅迫下LTP能夠保護(hù)維管束組織層細(xì)胞。YU等[34]分離出3個I類型家族的LTP基因,研究表明,TaLTPIb.1和TaLTPIb.5基因在受到干旱和冷脅迫后表達(dá)量均升高,而在黑暗處理后表達(dá)量不變,而TaLTPId.1在黑暗處理后表達(dá)量卻有上升趨勢。進(jìn)一步研究表明,在過表達(dá)擬南芥中發(fā)現(xiàn),冷脅迫條件下增加了3個轉(zhuǎn)基因植株的根長,TaLTPId.1基因在表達(dá)上的不同可能是因?yàn)榧易寤騺喒δ芑脑?。HELA等[37]從小麥中分離的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TdLTP4,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在NaCl,ABA,JA和H2O2脅迫過程中比野生型表現(xiàn)優(yōu)越,過量表達(dá)小麥TaLTP3的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐熱性和氧化應(yīng)激反應(yīng)比野生型有所提高[40]。LI等通過同源克隆在小麥中獲得LTP基因,過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn),該基因能夠提高植株抗鹽脅迫能力[41]。
小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一,在我國小麥播種面積約占糧食作物的27%,在糧食生產(chǎn)中具有舉足輕重的作用[42],而其生長發(fā)育易受到病蟲害等生物脅迫與干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫的影響。作為世界上主要的農(nóng)作物,小麥抗逆性研究和抗逆育種成為當(dāng)今研究的重要課題。而脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物生物脅迫和非生物脅迫方面均發(fā)揮一定的作用,迄今為止,人們對其作用機(jī)制研究得不是很透徹,但隨著科技的發(fā)展,人們將會通過深入研究和利用LTP蛋白作用機(jī)制,為充分發(fā)揮其基因功能對改良小麥等糧食作物奠定基礎(chǔ)。