補(bǔ)腎活血方對(duì)缺氧/復(fù)氧環(huán)境下bMSC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用

黃映紅，曾潔萍，張淼，謝茜

近年來(lái)，骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cell, bMSC ）通過(guò)細(xì)胞替代和營(yíng)養(yǎng)支持治療缺血性腦卒中的應(yīng)用越來(lái)越受到關(guān)注[1～2]。但bMSC在缺血損傷微環(huán)境下存活率低、分化失調(diào)、難以定向遷移等問(wèn)題的存在限制了其臨床應(yīng)用。增強(qiáng)bMSC對(duì)損傷微環(huán)境的耐受性是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。研究表明，缺血缺氧等損傷因素會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein reaction,UPR），進(jìn)而通過(guò)觸發(fā)泛素酶體途徑以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。但當(dāng)UPR介導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)仍難以減少錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)終將失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將作為觸發(fā)信號(hào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。本研究以缺氧/復(fù)氧環(huán)境下bMSC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡為切入點(diǎn)，旨在探討補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方對(duì)bMSC的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物 bMSC分離用4～5周齡SPF級(jí)SD大鼠（體重約100g～120g），雌雄不限；含藥血清制備選用8～10周齡SPF級(jí)SD大鼠（體重200±20g），雌雄各半。以上實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動(dòng)物許可證：SCXK（川）2015-30。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥物及主要試劑 補(bǔ)腎活血方組成：熟附片5 g，巴戟天15 g，山茱萸15 g，熟地20 g，肉蓯蓉15 g，五味子15 g，麥冬15 g，石菖蒲10 g，遠(yuǎn)志10 g，丹參15 g，當(dāng)歸20 g，川芎10 g。購(gòu)自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；依達(dá)拉奉注射液（昆明積大制藥股份有限公司，170513）；低糖DMEM（Hyclone，SH30021.01）；胎牛血清（Cellmax，SA212.01）；MTT試劑盒（購(gòu)自南京建成）；兔抗ATF6抗體（Proteintech group，24169-1-AP）；兔抗Tublin抗體（Cell Signaling Technology，2148）；BCA蛋白定量試劑盒（Cell Signaling Technology，7780）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Aidlab，TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit）；2×SYBR? Green預(yù)混液（德國(guó)DBI）。

1.2 補(bǔ)腎活血方含藥血清的制備

補(bǔ)腎活血方全方用水浸泡后濃煎取汁，制備濃度為含原生藥11.88、5.94、2.97 g﹒mL-1的高劑量、中劑量和低劑量水煎液。

取8～10周齡的SPF級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、中藥高、中、低劑量組，每組10只。中藥高、中、低劑量組分別給予含原生藥59.4、29.7、14.85 g﹒kg-1的補(bǔ)腎活血方水煎液，分別相當(dāng)于按體表面積折算成人用藥等效劑量4、2、1倍?？瞻捉M大鼠給予等體積生理鹽水。各組均灌胃2 次/d，連續(xù)3d。第3 d最后一次給藥后禁食12 h，于第4天一次性給予全天劑量，1 h后股靜脈取血。全血于4℃下靜置2 h，3000 rpm離心15 min，取上層清亮液體，抽濾除菌，同組血清混和，56℃條件下滅活30 min，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠bMSC的分離、培養(yǎng)和鑒定

取4～5周齡SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后處死動(dòng)物。75%乙醇浸泡10 min，無(wú)菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，去除干骺端，DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨髓腔變白，收集沖洗液，200目篩過(guò)濾，收集濾液，1200 rpm離心5 min，棄上清，向沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，冰浴15 min，1500 rpm離心5 min，收集沉淀，PBS洗滌2次，用12%L-DMEM重懸細(xì)胞，并接種于75cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃、5 % CO2 及完全飽和濕度條件下孵育。48 h半量換液，72 h全量換液，以后每48h換液一次，原代細(xì)胞達(dá)到80%融合后，按1:2傳代，取2～3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取2～3代bMSCs接種于預(yù)置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，37℃、5 % CO2及完全飽和濕度條件下培養(yǎng)，制成細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70 %融合時(shí)取出玻片，行細(xì)胞免疫化學(xué)染色。CD44陽(yáng)性表達(dá)，但不表達(dá)CD34的細(xì)胞為bMSC。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

取2～3代細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，分為6組：①空白對(duì)照組：每孔加入含20%空白組血清的L-DMEM培養(yǎng)液；②模型對(duì)照組：每孔加入含20%空白組血清L-DMEM培養(yǎng)液；③中藥高劑量組：每孔加入含20%高劑量補(bǔ)腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；④中藥中劑量組：每孔加入含20%中劑量補(bǔ)腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；⑤中藥低劑量組：每孔加入含20%低劑量補(bǔ)腎活血方血清的L-DMEM培養(yǎng)液；⑥依達(dá)拉奉組：每孔加入含300 μmol﹒L-1依達(dá)拉奉注射液的L-DMEM培養(yǎng)液。

1.5 缺氧/復(fù)氧模型制備

缺氧處理前各組細(xì)胞均更換無(wú)血清培養(yǎng)液，5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細(xì)胞同步化。按實(shí)驗(yàn)分組更換相應(yīng)的含藥血清培養(yǎng)液和含藥培養(yǎng)液，迅速將除空白對(duì)照組以外的其它幾組細(xì)胞放入已預(yù)置缺氧化學(xué)催化劑（Anaero Pack，日本三菱）及缺氧指示條的缺氧盒中，密封缺氧盒，37℃條件下孵育6 h。6 h后從缺氧盒中取出培養(yǎng)板，5%CO2、37℃條件下再孵育2 h，終止培養(yǎng)。

1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

取3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的bMSC，按2×104個(gè)/mL接種于96孔板（空白對(duì)照組單獨(dú)鋪板，另五組細(xì)胞鋪于同一塊96孔板），每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞分組及給藥同1.4，每組10孔。細(xì)胞模型制備同1.5。37℃、5 % CO2及完全飽和濕度條件下孵育24 h后，每孔加入1× MTT溶液50 μL，37 ℃孵育4 h，棄孔內(nèi)液體，每孔加150 μLDMSO，水平搖床振蕩10 min，Tecan In finite M200 pro酶標(biāo)儀 于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A570。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A570/空白組A570）×100%

1.7 Real-time PCR測(cè)定CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量

使用 TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性。所得RNA采用Aidlab公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)引物后對(duì)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在analytikjena-qTOWER2.2型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)樣品均重復(fù)三次以避免加樣誤差，分析方法為ΔΔCt法。

根據(jù)NCBI公布的基因序列分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，選取GAPDH作為內(nèi)參基因。引物設(shè)計(jì)如下表：

表1 Q-PCR引物序列

1.8 Western blotting 測(cè)定ATF6的相對(duì)表達(dá)量

提取各組大鼠bMSC的總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，Western blotting檢測(cè) bMSC 的ATF6表達(dá)水平，ATF6一抗1:500稀釋，ɑ-Tublin一抗1:1000稀釋，二抗 1:1000稀釋。掃描PVDF膜上各條帶，Image J分析各條帶的平均光密度值，取目的蛋白與內(nèi)參ɑ-Tubulin平均光密度值的比值，表示bMSC內(nèi)ATF6的相對(duì)表達(dá)量，并比較各組細(xì)胞ATF6相對(duì)表達(dá)量的差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)均以±S表示，均數(shù)間的兩兩比較采用成組t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1bMSC形態(tài)觀察

原代有核細(xì)胞48～72 h完全貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核為卵圓形。原代細(xì)胞于6～8 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞克隆化生長(zhǎng)，形成大小不一的集落，12～15 d達(dá)到80%～90%融合。傳代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，24 h左右完全貼壁，4～5 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。(見(jiàn)圖1)

圖1 倒置顯微鏡下bMSC的形態(tài)特征（100×）

2.2 補(bǔ)腎活血方對(duì)缺氧/復(fù)氧環(huán)境下bMSC存活率的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組bMSC存活率明顯降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高、中、低劑量組和依達(dá)拉奉組bMSC存活率顯著增高（P＜0.05或P＜0.01）。（見(jiàn)表2）

表2 各組bMSC存活率的比較（x±S ，n=10）

2.3 補(bǔ)腎活血方對(duì)缺氧/復(fù)氧環(huán)境下bMSC中ATF6表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組bMSC內(nèi)ATF6相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高劑量組bMSC內(nèi)ATF6相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。（見(jiàn)圖2）

注：與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較：P＜0.05，P＜0.01

注：C代表空白對(duì)照組，M代表模型對(duì)照組，D代表中藥低劑量組，Z代表中藥中劑量組， G代表中藥高劑量組，E代表依達(dá)拉奉組

2.4 補(bǔ)腎活血方對(duì)缺氧/復(fù)氧環(huán)境下bMSC中CHOP mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組bMSC內(nèi)CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，補(bǔ)腎活血方高劑量組、中劑量組及依達(dá)拉奉組bMSC內(nèi)CHOP mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見(jiàn)圖3）

注：與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較：P＜0.05，P＜0.01

3 討論

bMSC是來(lái)源于骨髓的一種具有跨胚層分化潛能的成體干細(xì)胞，其在缺血損傷腦組織中的定植分化、旁分泌等效應(yīng)有助于修復(fù)受損組織[4～5]。目前認(rèn)為，bMSC所具有的內(nèi)在分化程序、所處微環(huán)境中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、黏附分子等因素與其增殖、分化密切相關(guān)。但腦缺血再灌注后，各種復(fù)雜的原發(fā)和繼發(fā)事件(如炎癥因子的釋放、神經(jīng)血管單元的受損和細(xì)胞死亡、各種損傷和抗損傷事件的對(duì)抗等)嚴(yán)重影響了bMSC的存活。因此，增強(qiáng)bMSC對(duì)損傷微環(huán)境的耐受性是干細(xì)胞研究中不容忽視的環(huán)節(jié)。

本研究選用補(bǔ)腎經(jīng)典方—地黃飲子配伍活血化瘀常用藥物組成補(bǔ)腎活血方。地黃飲子出自劉河間《黃帝素問(wèn)·宣明論方》，為臨床治療缺血性腦損傷的有效方[6～7]。方中附子、巴戟天、肉蓯蓉補(bǔ)腎陽(yáng)，山茱萸、熟地填腎精，麥冬、五味子補(bǔ)陰，當(dāng)歸、丹參、川芎養(yǎng)血活血，菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開(kāi)竅，全方陰陽(yáng)并補(bǔ)，水火相濟(jì)，共奏補(bǔ)腎填精、祛瘀化痰之功。實(shí)驗(yàn)研究亦表明地黃飲子具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能為改善HPA軸的紊亂、抗氧化和清除自由基、抑制神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖等[8～10]。另有研究證實(shí)，地黃飲子含藥血清孵育bMSC，能顯著提高bMSC移植對(duì)缺血性腦卒中的治療效果[11～12]。但有關(guān)地黃飲子對(duì)缺血損傷微環(huán)境中bMSC的保護(hù)作用及機(jī)制研究，還鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)翻譯后修飾、折疊組裝的場(chǎng)所。缺血、缺氧等病理因素破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，則會(huì)引發(fā)ERS，表現(xiàn)為大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，并啟動(dòng)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在三類感受器：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、激活作用轉(zhuǎn)錄因子-6（activating transcription factor 6，ATF6）、跨膜蛋白激酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）。早期ERS通過(guò)介導(dǎo)三條UPR信號(hào)通路，即PERK通路、ATF6通路、IRE1通路，以抑制蛋白質(zhì)合成、減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，或提高蛋白質(zhì)折疊能力，或通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白質(zhì)降解途徑清除未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞繼續(xù)存活。但如細(xì)胞遭受的刺激過(guò)強(qiáng)或ERS持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞難以維持或重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)就會(huì)作為凋亡信號(hào)的發(fā)起點(diǎn)[13～14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中重要信號(hào)分子—CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)可通過(guò)激活下游基因如DOCs（downstream of CHOP）或caspase-1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故CHOP的表達(dá)上調(diào)是ERS誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。因此，阻斷ATF6通路、下調(diào)CHOP的表達(dá)，減輕因缺血缺氧導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，是神經(jīng)保護(hù)藥物治療缺血性腦損傷的重要機(jī)制[16]。

本研究結(jié)果顯示，缺氧6 h/復(fù)氧2 h誘導(dǎo)下，bMSC存活率明顯降低；與此同時(shí)，bMSC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因ATF6、CHOP的表達(dá)豐度明顯增加。這一結(jié)果提示模擬缺血/再灌注損傷導(dǎo)致bMSC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，而bMSC存活率的降低與持續(xù)存在的ERS密切相關(guān)。給予補(bǔ)腎活血方含藥血清處理可顯著增強(qiáng)bMSC對(duì)缺氧損傷環(huán)境的耐受性，提高細(xì)胞存活率，該方的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制可能為抑制bMSC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而阻斷細(xì)胞凋亡。