外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗生理生化特性的影響

華智銳，李小玲

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)屬于唇形科黃芩屬多年生草本植物，以根入藥，具有抗菌、消炎、調(diào)節(jié)血脂及抗艾滋病病毒等功效，為大宗常用中藥材之一[1]。近幾年來，黃芩在中藥生產(chǎn)、黃酮化合物提取等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，市場(chǎng)需求量巨大[2]。但由于對(duì)野生黃芩資源的過度采挖，目前黃芩藥材生產(chǎn)主要來源仍然依靠人工的大田栽培和引種馴化，而日益加重的土壤鹽漬化現(xiàn)象給黃芩大田生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

硅是地球表面的第二大元素，對(duì)大多數(shù)高等植物的生長(zhǎng)有益[3]，有促進(jìn)植物(尤其是單子葉植物)的生長(zhǎng)和增加生物學(xué)產(chǎn)量的功能。硅對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響有直接和間接兩種途徑，直接途徑是指硅參與植物生理生化代謝過程，間接途徑則通過改善土壤氮、鉀等元素的利用效率而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4]。添加硅可以提高鹽脅迫下玉米幼苗地上部和根系干重，增加其根冠比[3]。研究表明，硅(K2SiO3)能促進(jìn)植株的生長(zhǎng)，還能改善植株對(duì)礦物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)吸收[5]。另外，硅在提高植物對(duì)生物及非生物脅迫抗性方面也具有重要作用[5]。Liang(1998)[6]研究發(fā)現(xiàn)，加入適宜濃度的外源硅可減輕鹽脅迫下大麥葉綠體的結(jié)構(gòu)損傷，有利于保護(hù)葉綠體膜的完整性。在鹽脅迫條件下適宜濃度的外源硅會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng)[3]。外源硅不僅能提高干旱脅迫下番茄根系線粒體活性氧清除酶的活性，減輕活性氧的積累和膜脂過氧化程度，還有利于維持根系細(xì)胞及重要細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而增強(qiáng)植株的抗旱性[6]。硅處理后大麥幼苗根系的CAT、SOD、POD、GSH活性提高，丙二醛含量降低，從而使大麥鹽脅迫的過氧化傷害程度降低。硅能增強(qiáng)鹽脅迫下玉米硝酸還原酶的活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，提高葉片的光合速率[3]，增強(qiáng)葉綠體清除活性氧的能力，從而緩解鹽脅迫對(duì)葉綠體膜的傷害[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取一年生商洛黃芩幼苗進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，待植株在盆中培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3個(gè)月時(shí)，進(jìn)行處理并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 預(yù)處理：將所購(gòu)買的黃芩幼苗移栽至直徑40 cm、高55 cm左右的花盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，在此期間定時(shí)進(jìn)行澆水和松土以保持土壤濕潤(rùn)。3個(gè)月后選取生長(zhǎng)一致的黃芩幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)共設(shè)6組，兩個(gè)對(duì)照組和4個(gè)試驗(yàn)組：CK1(蒸餾水對(duì)照)；CK2(0.5%鹽對(duì)照)；Si0，0.01 g/L K2SiO3+0.5% NaCl；Si1，0.025 g/L K2SiO3+0.5% NaCl；Si2，0.05 g/L K2SiO3+0.5% NaCl；Si3，0.1 g/L K2SiO3+0.5% NaCl。對(duì)上述6組試驗(yàn)用不同濃度外源硅采用灌根方式處理8 d(每2 d處理一次)，然后選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株進(jìn)行試驗(yàn)。摘取適宜的葉片，洗凈，用蒸餾水沖洗，取出主葉脈后，剪碎，用于測(cè)定幼苗保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性、丙二醛(MDA)和脯氨酸的含量等生理指標(biāo)。

1.2.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

1.2.3.1 過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定 酶液的提?。悍Q取0.5 g黃芩葉片于研缽中，加入2 mL磷酸緩沖液，研成勻漿，將其轉(zhuǎn)入離心管中，于8000 r/min下離心10 min；取上清液轉(zhuǎn)入25 mL 容量瓶，沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提一次，上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶定容。

POD的測(cè)定：加入20 μL酶液、3 mL反應(yīng)液于比色皿中，在470 nm下每隔1 min讀1次數(shù)，共讀3次，以每分鐘吸光度變化值計(jì)算POD活性：POD活性[(△A470/(min·g )]=△A470×V/Va/W=△A470×5/0.02/0.5=△A470×500 。式中△A470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值；V為提取酶液總體積(mL)；W為黃芩葉片鮮重(g)；Va為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL)。

1.2.3.2 過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定 酶液提?。悍Q取黃芩葉片0.5 g置于研缽中，加入2～3 mL 4 ℃下預(yù)冷的磷酸緩沖液和少許石英砂，研磨成勻漿，然后轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用緩沖液沖洗研缽后合并沖洗液，并定容至刻度，混合均勻，將容量瓶置5 ℃冰箱中靜止10 min，取上清液于4000 r/min下離心15 min，5 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

CAT的測(cè)定：0.1 mL酶液+2.5 mL反應(yīng)液，在240 nm下比色，每隔1 min讀數(shù)1次，共讀3次。

班主任工作是平凡而繁瑣的工作，我們只有從點(diǎn)滴做起，從小事做起，因勢(shì)利導(dǎo)，做到潤(rùn)物細(xì)無聲。澆灌出一朵朵希望之花，讓這些美麗的花朵，盛開在祖國(guó)肥沃的土地上。

結(jié)果計(jì)算：CAT活性[△A240/(min·g)]=△A240×V/Va/W=△A240×5/0.05/0.5=△A240×200。△A240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)OD變化值。

1.2.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 酶液提?。悍Q取黃芩葉片0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，取2 mL于1000 r/min下離心20 min，上清液即為SOD粗提液。

SOD的測(cè)定：取型號(hào)相同的試管，吸取20 mL酶液，加入3 mL反應(yīng)液，4000 lx照光30 min，同時(shí)取4支試管，3支作對(duì)照，1支做空白(不加酶液，以緩沖液代替)；空白管放置暗處，對(duì)照(CK)與酶液同置于4000 lx條件下光照30 min，避光保存，以空白調(diào)零，于560 nm條件下比色。

將NBT光還原50%定義為一個(gè)SOD活性單位。SOD總活性(吸光度/g)=(ACK-AE)×V/(W×0.5×ACK) 。

ACK為照光對(duì)照管反應(yīng)液的吸光度；AE為樣品管反應(yīng)混合液的吸光度；V為提取酶液總體積(mL)；W為黃芩葉片鮮重(g)。

SOD比活性(酶單位/mg)=SOD總活性/蛋白質(zhì)濃度。

1.2.3.4 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 MDA提取：稱取黃芩葉片0.5 g置于研缽中，加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)和少量的石英砂，研磨至勻漿，再加入8 mL 10% TCA進(jìn)一步研磨，將其轉(zhuǎn)入離心管，于4000 r/min下離心10 min，除去沉淀，上清液即為樣品提取液。

顯色反應(yīng)及測(cè)定：取提取液2 mL(對(duì)照加2 mL蒸餾水)，加入2 mL 0.6% TBA(硫代巴比妥酸)液，轉(zhuǎn)入試管中(試管加塞)沸水浴15 min，迅速冷卻后，在4000 r/min下離心2 min。取上清液分別測(cè)定532 nm、600 nm和450 nm條件下的吸光值。

結(jié)果計(jì)算：MDA(μmol/g)=[6.45×(D532-D600)-0.56×D450]×0.015/W或[6.45×(D532-D600)-0.56×D450]×0.03/W。式中D450、D532、D600分別為在450、532、600 nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值；W為黃芩葉片鮮重(g)。

1.2.3.5 脯氨酸含量的測(cè)定 提取脯氨酸：分別稱取胚軸，每種處理各取3份，每份0.3 g，剪碎，加入適量80%乙醇、少量石英砂，于研缽中研磨成勻漿，將勻漿液全部轉(zhuǎn)移至25 mL刻度試管中后用80%乙醇沖洗研缽，將洗液移入相應(yīng)的試管中，最后用80%乙醇定容至刻度，混勻，80 ℃水浴中提取20 min。

脯氨酸的測(cè)定：稱取黃芩葉片0.3 g，加入5 mL磺基水楊酸，加蓋，沸水浴10 min，過濾，吸取濾液2 mL(同時(shí)作空白，吸取2 mL蒸餾水)、2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮，沸水浴40 min，冷卻，再加入5 mL甲苯，充分振蕩，靜止分層，取上層甲苯溶液于比色皿中，于520 nm下比色。

結(jié)果計(jì)算：脯氨酸含量(μg/g)=C×V/Va/W。其中，C為脯氨酸濃度；V為提取酶液總體積(mL)；W為黃芩葉片鮮重(g)；Va為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 所有處理每次測(cè)定均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取3次測(cè)定的平均值，采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPASS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中過氧化物酶(POD)活性的影響

由圖1可知，在0.5% NaCl處理下POD活性比CK1明顯下降；在0.5% NaCl脅迫下隨著外源硅濃度的升高POD的活性呈先升后降的趨勢(shì)，其中Si0、Si1、Si2、Si3的活性與對(duì)照(CK2)相比分別提高了33.33%、100%、120%、86.67%。Si2處理的POD活性達(dá)到最佳，是CK2的2.2倍，差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)。而Si1、Si2、Si3的活性與對(duì)照(CK1)相比分別提高了20%、32%、12%；在Si2下POD活性達(dá)到最佳，是CK1的1.32倍，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。由此可知，與對(duì)照相比，Si2處理(0.05 g/L K2SiO3)能有效提高POD的活性，緩解鹽脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。

圖1 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中POD活性的影響

2.2 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中過氧化氫酶(CAT)活性的影響

由圖2可知，在0.5% NaCl處理下CAT的活性比CK1明顯下降；在0.5% NaCl脅迫下隨著外源硅濃度的升高CAT的活性呈先升后降的趨勢(shì)，其中Si0、Si1、Si2、Si3的活性與對(duì)照(CK2)相比分別提高了11.1%、52.3%、60.4%、11.5%；在Si2下CAT活性達(dá)到最佳，分別是CK1、CK2的1.08、1.60倍，差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；而Si1、Si2處理的CAT活性與對(duì)照(CK1)相比分別提高了2.7%、8.3%。由此可知，與對(duì)照相比，Si2處理(0．05 g/L K2SiO3)能有效提高CAT的活性，緩解鹽脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。

圖2 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中CAT活性的影響

2.3 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中過氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

由圖3可知，0.5% NaCl處理的SOD活性比CK1有所下降；在 0.5% NaCl脅迫下隨著外源硅濃度升高SOD的活性呈先升后降的趨勢(shì)，其中Si0、Si1、Si2、Si3的活性與對(duì)照(CK2)相比分別提高了25.2%、39.4%、6.7%、1.8%；Si1處理的SOD活性達(dá)到最佳，分別是CK1、CK2的1.19、1.39倍，差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)，而Si0、Si1的SOD活性與對(duì)照(CK1)相比分別提高了7.0%、19.2%。由此可知，與對(duì)照相比，Si1處理(0．025 g/L K2SiO3)能有效提高SOD的活性，緩解鹽脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害。

圖3 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中SOD活性的影響

2.4 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中丙二醛(MDA)含量的影響

由圖4可知，0.5% NaCl處理的MDA含量比CK1明顯上升，增加了71.3%；不同濃度的外源硅在0.5% NaCl脅迫下對(duì)商洛黃芩幼苗葉片中MDA含量的影響存在不同差異，隨著外源硅濃度的增加MDA含量基本上呈先增后降的趨勢(shì)，在Si2時(shí)達(dá)到最高，與CK1相比增加了48.3%。各濃度硅處理中MDA含量均顯著低于CK2(P<0.05)，Si0、Si3處理中MDA含量均顯著低于CK1，而Si1、Si2處理中的與CK1相比分別增加了9.2%、48.3%。由此可見，外源硅可緩解鹽脅迫對(duì)黃芩的傷害，降低細(xì)胞膜傷害程度。

圖4 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中丙二醛含量的影響

2.5 外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中脯氨酸含量的影響

由圖5可知，鹽脅迫處理(CK2)能夠增加黃芩葉片中的脯氨酸含量，與對(duì)照(CK1)相比增加了71.9%；不同濃度的外源硅在0.5% NaCl脅迫下對(duì)黃芩幼苗葉片中脯氨酸含量的影響存在不同差異，隨著外源硅濃度的升高，黃芩葉片中的脯氨酸含量呈先增后降的趨勢(shì)；在Si1時(shí)達(dá)到最高，是CK1的1.5倍；各濃度硅處理中脯氨酸含量均顯著低于CK2(P<0.05)；與對(duì)照CK1相比，Si0、Si1、Si2、Si3處理中脯氨酸含量分別增加了40.6%、50.0%、28.1%、6.3%。由此可見，外源硅可降低鹽脅迫下脯氨酸的積累量。

3 討論

SOD是植物處于逆境條件下細(xì)胞內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)中的重要抗氧化酶，對(duì)維持植物體內(nèi)的活性氧代謝的平衡和保護(hù)膜結(jié)構(gòu)起著重要作用，能提高植物組織的抗氧化能力[8]；其與超氧化物陰離子自由基(O2-)發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，生成的H2O2可以被過氧化氫酶(CAT)分解成O2和H2O，可以避免H2O2積累對(duì)細(xì)胞的氧化破壞作用。在本研究的鹽脅迫條件下，不同濃度外源硅明顯提高了黃芩幼苗中SOD、POD、CAT的活性，這與沙灘黃芩[9]、黃瓜[10]、甘草[11]的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中，在0.5% NaCl脅迫下，用不同濃度外源硅處理商洛盆栽黃芩幼苗，發(fā)現(xiàn)黃芩幼苗中SOD、POD、CAT活性緩解趨勢(shì)相似，其中SOD、POD、CAT活性均高于鹽對(duì)照組(CK2)。由此說明不同濃度外源硅具有提高鹽脅迫下黃芩幼苗中SOD、POD、CAT活性的作用，其中POD、CAT活性在Si2處理時(shí)表現(xiàn)最佳，SOD活性在Si1時(shí)效果最明顯。

圖5外源硅對(duì)鹽脅迫下黃芩幼苗中脯氨酸含量的影響

鹽脅迫會(huì)嚴(yán)重危害植物的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和組成。由于鹽脅迫中離子的脅迫作用改變植物的細(xì)胞膜功能，質(zhì)膜受到傷害，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，隨著逆境加劇膜破壞的程度增加[7]。在鹽脅迫下，植物最先接觸到鹽分并且受到傷害的是細(xì)胞質(zhì)膜，并導(dǎo)致膜的透性增大和膜脂過氧化加劇，而膜脂過氧化產(chǎn)物對(duì)植物的防御體系破壞又再次加重了膜脂的過氧化作用程度。已有研究表明，加外源硅處理可顯著降低植物葉片電解質(zhì)外滲率和過氧化物產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量[12-13]。

丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，它能夠與膜蛋白發(fā)生交聯(lián)作用，使膜的透性增大；又可以與細(xì)胞內(nèi)的各種成分發(fā)生反應(yīng)，使膜系統(tǒng)中的多種酶生理功能嚴(yán)重受到損害。因此，可以用MDA的含量來代表植物膜脂過氧化作用的強(qiáng)弱，反映植物受傷害的程度和植物對(duì)逆境的反應(yīng)[9，14]，所以在鹽脅迫下MDA含量的高低可反映黃芩幼苗葉片中生物膜受傷害的程度及其耐鹽性的強(qiáng)弱。在0.5% NaCl脅迫下，MDA的含量增加，經(jīng)過不同濃度的外源硅處理后的黃芩幼苗中MDA含量均低于對(duì)照組(CK2)，說明不同濃度的外源硅可以緩解膜脂過氧化的過程，降低MDA的含量。研究表明，隨著外源硅濃度的增加MDA的含量基本上呈先增后降的趨勢(shì)，各濃度硅處理中MDA含量均顯著低于CK2(P<0.05)，Si0、Si3中MDA含量均顯著低于CK1(P<0.05)，由此說明適宜濃度的外源硅可緩解鹽脅迫對(duì)黃芩幼苗的傷害，且當(dāng)外源硅達(dá)到一定濃度時(shí)還可降低細(xì)胞膜傷害程度。

脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 在鹽脅迫下植物體內(nèi)大量積累脯氨酸, 可以避免細(xì)胞內(nèi)外滲透勢(shì)失衡而造成植物細(xì)胞的生理性缺水,有助于增加細(xì)胞的持水力,從而保護(hù)原生質(zhì)和質(zhì)膜的完整性[10]。在逆境脅迫條件下，與不耐鹽植物相比，耐鹽植物體內(nèi)積累了更多的脯氨酸，能提高植物的耐鹽性。本試驗(yàn)中，黃芩幼苗受到鹽脅迫后，脯氨酸含量顯著增大，各濃度硅處理中脯氨酸含量均顯著低于CK2(P<0.05)，與對(duì)照CK1相比Si0、Si1、Si2、Si3處理中脯氨酸含量分別增加了40.6%、50.0%、28.1%、6.3%，且小于CK2，由此可見，不同濃度的外源硅可降低鹽脅迫下脯氨酸的積累量，這可能是硅緩解黃芩幼苗鹽分傷害的一種生理響應(yīng)機(jī)制。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，用不同濃度外源硅處理鹽脅迫下商洛盆栽黃芩幼苗，可使SOD、POD、CAT活性增加，提高植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，增強(qiáng)植物的抗逆性；同時(shí)可降低鹽脅迫下丙二醛(MDA)和脯氨酸的積累量，緩解鹽脅迫對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度。本試驗(yàn)結(jié)果為黃芩的耐鹽性研究提供了參考，也為利用外源硅作為化控措施以緩解黃芩鹽害提供了理論依據(jù)。但本研究主要是通過盆栽試驗(yàn)完成了相關(guān)數(shù)據(jù)采集，在黃芩的大田栽培試驗(yàn)真實(shí)環(huán)境中相關(guān)生理指標(biāo)和響應(yīng)機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步進(jìn)行。

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