誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)聯(lián)性研究

韓京軍 張艷煒 伍德強 張磊 張晶

518033 深圳，中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院心胸外科(韓京軍、伍德強、張磊、張晶)；518055深圳市疾病預(yù)防控制中心分子生物醫(yī)學(xué)檢驗科(張艷煒)

《全球疾病負擔(dān)報告2013》顯示，1990—2013 年高收入地區(qū)的心血管疾病病死率下降了22%[1]?！吨袊难懿蟾?016》顯示，中國心血管病(包括冠心病和腦血管病)現(xiàn)患人數(shù)已高達2.9億，心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上，為我國居民的首位死因。其中冠心病是受環(huán)境因素和遺傳因素相互作用、發(fā)病機制十分復(fù)雜的多基因疾病[2-3]。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種信號因子，可以通過調(diào)節(jié)血管舒張收縮反應(yīng)、參與機體炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，直接或間接地影響動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生與發(fā)展。人體內(nèi)存在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)基因的3種亞型，其中誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化釋放的NO自由基可引起血管內(nèi)皮損傷、促進血管壁炎癥反應(yīng)，在AS發(fā)生與發(fā)展的調(diào)節(jié)機制中起著重要的作用[4]。目前為止，國內(nèi)外均較少見到有關(guān)iNOS基因多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)性的研究報道。本研究主要針對iNOS基因的2個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與冠心病的關(guān)聯(lián)進行初步探討。

1 對象和方法

1.1 研究對象

病例組291例來源于2015 年6月至2017 年2月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院心臟中心住院的漢族冠心病患者。入選標準：符合世界衛(wèi)生組織臨床命名的《缺血性心臟病的命名及診斷標準》，即冠狀動脈造影結(jié)果顯示在主要冠狀動脈血管中，至少存在1支血管內(nèi)徑狹窄超過50%。對照組487名來自于同期年齡、性別匹配的門診健康體檢者，經(jīng)詢問病史、問卷調(diào)查、心臟核素掃描、CT冠狀動脈成像或冠狀動脈造影等檢查排除冠心病。所有研究對象均無任何血緣關(guān)系，排除心肌病、腦血管病、肺源性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、充血性心力衰竭、周圍血管性疾病、肝腎疾病及其他惡性腫瘤。

1.2 資料收集

采用病例-對照研究設(shè)計方案。通過統(tǒng)一的自制調(diào)查問卷對入選的研究對象進行調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容主要包括：年齡、性別、體重、身高、民族、籍貫、是否吸煙、是否喝酒，是否患有高血壓、糖尿病、高脂血癥，是否有冠心病家族史等。

高血壓診斷標準：收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg或目前正在服用降壓藥。糖尿病診斷標準：空腹血糖≥7.0 mmol/L，或目前正在服用降糖藥。高脂血癥診斷標準：三酰甘油(triglyceride，TG)>1.70 mmol/L，總膽固醇(total cholesterol，TC)>5.72 mmol/L，或目前正在服用降脂藥。

調(diào)查過程中所有研究對象均簽署知情同意書，并由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員通過詢問患者家屬及之前的診查記錄等方法進行數(shù)據(jù)質(zhì)控。通過病案系統(tǒng)調(diào)取患者和健康體檢者血液檢查結(jié)果，包括TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖、尿酸等。本研究通過中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(2016-420)。

1.3 iNOS基因多態(tài)性檢測

所有受檢者空腹12～15 h，于次日晨8：00時抽取外周靜脈血3 ml，置于5 ml的EDTA抗凝管中混勻，4℃冰箱保存不超過12 h，離心分裝于1.5 ml EP管中，編碼保存于-80℃冰箱，準備提取DNA。用AXYGEN公司的全血基因組DNA提取試劑盒抽提DNA；其后用核酸檢測儀檢測其濃度和純度。DNA存放于-80℃冰箱。

采用Taqman探針法對iNOS基因的rs2779248、rs1137933的基因型進行檢測，預(yù)期擴增片段在150 bp左右。位點的上、下引物和探針均由美國ABI公司合成，序列見表1。反應(yīng)體系為：2×TIANtough Genotyping PreMix 10 μl，40×Taq Man SNP Genotyping Assays 0.5 μl，50×ROXReferece Dye 0.4 μl，Rnase-Free ddH2O 7.1 μl，模版DNA 2 μl 組成。在ABI Step One Plus熒光PCR儀上執(zhí)行如下程序：60℃ 30 s，95℃ 2 min，95℃ 20 s， 60℃ 32 s共40個循環(huán)，最后60℃ 30 s結(jié)果判定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

病例組共納入291例漢族冠心病患者，其中男性203例，占69.8%，平均年齡(59.9±10.2)歲；對照組共納入487名健康體檢者，其中男性354例，占72.7%，平均年齡(59.2±10.1)歲。病例組和對照組的年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，病例組的高血壓、糖尿病、高脂血癥的比例明顯升高，而飲酒比例則降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。與對照組比較，病例組的TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均降低，而血糖和血尿酸水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，見表2。

2.2 遺傳平衡檢驗

兩組rs2779248、rs1137933的基因型分布頻率見表3、4。將對照組的iNOS各基因型頻率代入Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，進行群體代表性檢驗，結(jié)果顯示iNOS各基因型頻率與期望值基本吻合，χ2值分別為0.803和0.013，P>0.05。這兩個SNP的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2.3 SNP基因型頻率分布及其與冠心病的關(guān)聯(lián)性

表1 研究位點的引物和探針

表2 研究對象一般人口特征和相關(guān)因素分布

注：TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

表3 rs2779248基因型及等位基因的分布

注：MAF：最小等位基因頻率

rs2779248 T等位基因分布頻率病例組(20.45%)高于對照組(18.69%)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與CC基因型相比，CT基因型攜帶者的冠心病發(fā)病風(fēng)險增加1.08倍(95%CI：0.79～1.48)，TT基因型攜帶者可以增加1.75倍的發(fā)病風(fēng)險(95%CI：0.82～3.76)，CT+TT基因型攜帶者發(fā)病風(fēng)險增加1.14倍(95%CI：0.84～1.54)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

rs1137933 T等位基因分布頻率病例組(20.45%)明顯高于對照組(15.91%)，T等位基因攜帶者冠心病發(fā)病風(fēng)險增加1.36倍(95%CI：1.04～1.77)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。與CC基因型相比，CT基因型攜帶者的冠心病發(fā)病風(fēng)險增加1.29倍(95%CI：0.93～1.77)，TT基因型攜帶者增加2.16倍(95%CI：0.98～4.76)，CT+TT基因型攜帶者增加1.36倍(95%CI：1.00～1.85)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

2.4 多因素Logistic回歸分析

以分類變量有無冠心病為應(yīng)變量，將高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙、飲酒等傳統(tǒng)危險因素作為自變量放入多因素Logistic回歸模型，發(fā)現(xiàn)rs2779248 TT基因型是冠心病易感危險因素(OR=2.58，95%CI：1.01～6.67，P=0.048)，見表3，而rs1137933基因多態(tài)性卻未顯示出這種危險關(guān)系。

2.5 各基因型間生化指標差異分析

以各位點3個不同基因型進行分組，進行生化指標差異分析。兩個位點3個基因型間TG、TC、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和血尿酸差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。rs2779248TT基因型攜帶者空腹血糖[(6.74±4.13)mmol/L]明顯高于CC基因型攜帶者[(5.75±2.20)mmol/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.045)。rs1137933 TT基因型攜帶者空腹血糖[(7.01±4.24)mmol/L]明顯高于CT基因型攜帶者[(5.66±1.74)mmol/L]和CC基因型攜帶者[(5.79±2.32)mmol/L]，P=0.009和0.015，見表5、圖1。

3 討論

本研究表明，iNOS基因rs2779248和rs1137933等位基因C>T突變與漢族人群冠心病遺傳易感性有關(guān)。rs1137933 T等位基因可以增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險；在校正相關(guān)危險因素后，rs2779248 TT基因型是冠心病發(fā)生的獨立危險因素。同時在比較兩個位點各基因型間生化指標差異時發(fā)現(xiàn)，突變基因型攜帶者空腹血糖水平均明顯高于野生基因型攜帶者，由此我們推測iNOS基因可能通過調(diào)控血糖而影響動脈粥樣硬化斑塊的形成過程，進而增加冠心病的發(fā)病風(fēng)險。課題組前期在缺血性腦卒中遺傳易感性的研究中發(fā)現(xiàn)，rs2779248和rs1137933與中國漢族人群缺血性腦卒中易感性存在顯著相關(guān)性[5]，而冠心病和缺血性腦卒中有著幾乎相同的病理基礎(chǔ)和高危因素。

表4 rs1137933基因型及等位基因的分布

注：MAF：最小等位基因頻率

表5 rs2779248和rs1137933各基因型間生化指標的差異分析

注：TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

圖1 rs2779248和rs1137933各基因型間空腹血糖比較

iNOS由NOS2A基因編碼翻譯，該基因定位于第17號染色體，基因長度為37 kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子，是由1 153個氨基酸組成的蛋白質(zhì)[6]。正常情況下，NO可以通過抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集和粘附、抑制白細胞激活和附著等作用起到預(yù)防AS發(fā)生的作用[6]。iNOS在正常的內(nèi)皮細胞中表達很低，但在炎癥反應(yīng)或缺血缺氧、高血糖等氧化應(yīng)激情況下，iNOS表達增強并合成大量的、可能產(chǎn)生細胞毒性的NO[7]。由iNOS誘導(dǎo)6～8 h后合成的NO總量是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)合成總量的幾千倍[8]。過多的NO與過氧化物一起導(dǎo)致過氧化，引起組織損傷[9]。iNOS可能通過增加氧化應(yīng)激在血管壁上形成損傷，進而加劇動脈硬化斑塊的形成[10]。目前關(guān)于iNOS與冠狀動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的確切發(fā)病機制并不清楚，Buttery等[11]研究顯示，iNoS的tuRNA在AS血管的巨噬細胞和血管平滑肌細胞中呈高表達。萬鑫等[12]研究發(fā)現(xiàn)，iNOS基因多態(tài)性與腦動脈粥樣硬化相關(guān)。

本研究選取漢族冠心病患者和健康體檢人群作為研究對象，比較分析了iNOS基因rs2779248、rs1137933兩個SNP基因型及等位基因的分布，明確了iNOS基因rs2279248和rs1137933多態(tài)性與漢族人群冠心病發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)這兩個位點各基因型間血糖水平存在顯著差異，提示iNOS基因可能通過調(diào)控血糖進而影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展。為進一步確定以上結(jié)論，尚需要更大的樣本量進行驗證，并需要更加深入的機制研究。

本研究屬于病例對照研究，不可避免會存在研究對象選擇偏倚問題；同時由于樣本量偏少，缺少環(huán)境-遺傳因素間交互作用的分析，尚需進一步深入研究。

利益沖突：無

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