子宮內(nèi)膜癌患者病灶超聲造影成像檢查結(jié)果、增殖凋亡基因編碼蛋白表達(dá)及其相關(guān)性分析

回亞男，郝桂純，楊靜，史藝

(1 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193；2 天津市第三中心醫(yī)院)

子宮內(nèi)膜癌作為女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，每年有超過28萬的子宮內(nèi)膜癌患者，占所有惡性腫瘤的7%，發(fā)病率和病死率分別占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位和第二位，多發(fā)于中老年婦女[1,2]。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，并且發(fā)病人數(shù)趨于年輕化[3,4]。目前臨床上主要通過手術(shù)治療子宮內(nèi)膜癌，但是術(shù)后仍有超過10%的患者復(fù)發(fā)，子宮內(nèi)膜癌復(fù)發(fā)患者的平均生存期不足1年，因此對(duì)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行早期診斷具有重要意義[5]。超聲造影成像是近年來新興的無創(chuàng)性檢查手段，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌、甲狀腺癌等多種惡性腫瘤的病情評(píng)估。超聲造影成像通過時(shí)間-強(qiáng)度曲線，計(jì)算相應(yīng)參數(shù)，反映子宮內(nèi)膜癌患者病灶情況[6,7]。雖然子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但是細(xì)胞增殖和凋亡程序紊亂與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展密切聯(lián)系[8，9]。超聲造影成像參數(shù)和增殖、凋亡基因表達(dá)對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防和早期診斷具有重要意義，但是兩者的相關(guān)性研究并不多見。檢測腫瘤組織增殖、凋亡基因表達(dá)需要病理活檢，相對(duì)來說超聲造影成像更容易實(shí)施。本研究探討子宮內(nèi)膜癌患者超聲造影參數(shù)與病灶組織中增殖、凋亡基因編碼蛋白(Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4和CDK6)表達(dá)的關(guān)系，旨在進(jìn)一步明確超聲造影成像的臨床意義，幫助臨床工作者實(shí)現(xiàn)降低子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率和提高臨床療效的最終目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年5月收治的子宮內(nèi)膜癌患者79例，為子宮內(nèi)膜癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者臨床資料完整，且臨床依從性高；②患者術(shù)前均行行超聲造影檢查，未進(jìn)行放化療；③均行子宮切除術(shù)治療；④術(shù)中留取腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為子宮內(nèi)膜癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的臟器病變；②合并消化、血液及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾??；③中途退出研究者；④同時(shí)參與多個(gè)試驗(yàn)的患者。入組患者年齡32～67(47.62±3.05)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.65～23.02(21.73±1.03)kg/m2；子宮膜厚度3.13～5.52(4.69±0.68)mm；病理分期Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期32例；分化程度低分化30例，中分化25例，高分化24例。留取其術(shù)中切取的子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本。另選擇行子宮切除術(shù)的53例子宮肌瘤患者為子宮肌瘤組，，患者年齡32～68(47.79±3.12)歲；體質(zhì)量指數(shù)19.53～23.07(21.59±1.02)kg/m2?；颊咝g(shù)前均接受過超聲造影檢查，術(shù)中均留取子宮肌瘤組織標(biāo)本。所有留取組織標(biāo)本凍存于-80 ℃冰箱中待測。兩組患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)相比P均>0.05。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均已簽署知情同意書。

1.2 兩組病灶超聲造影檢查方法 兩組患者術(shù)前均取膀胱截石位進(jìn)行超聲造影檢查，首先行經(jīng)陰道常規(guī)二維超聲及彩色多普勒超聲確定病灶部位及周邊血流情況，選擇最佳的觀察面，然后肘靜脈注射Sono Vue造影劑2.4 mL，掃描病灶組織。用QLAB軟件計(jì)算感興趣區(qū)域(病灶)的峰值強(qiáng)度(Peak)、達(dá)峰時(shí)間(TTP)和造影劑平均渡越時(shí)間(MMT)。

1.3 兩組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6蛋白檢測 采用Western blotting法。子宮內(nèi)膜癌每個(gè)樣本中加入4倍濕重的蛋白裂解緩沖液，剪碎、超聲勻漿粉碎后，4 ℃下靜置1 h。以15 000 r/min的速度4 ℃離心10 min，離心半徑為3 cm，提取上清液，即得總蛋白。依次采用SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印，并采用脫脂奶粉進(jìn)行封閉，滴加一抗后，4 ℃下過夜孵育；二抗在室溫下孵育2 h，然后使用ECL顯色。結(jié)果采用Image J軟件半定量分析條帶的光密度值，陰性對(duì)照組為β-actin，以Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4和CDK6蛋白條帶與β-actin條帶的光密度值之比表示各蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組重復(fù)操作3次，求平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病灶Peak、MTT、TTP比較 子宮內(nèi)膜癌組和子宮肌瘤組病灶Peak、MTT、TTP見表1。子宮內(nèi)膜癌組病灶Peak、MTT、TTP均高于子宮肌瘤組病灶(P均<0.05)。

表1 兩組患者病灶Peak、MTT、TTP比較

注：子宮肌瘤組相比，#P<0.05。

2.2 兩組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對(duì)表達(dá)量比較 子宮內(nèi)膜癌組和子宮肌瘤組病灶組織Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對(duì)表達(dá)量見表2。子宮內(nèi)膜癌組病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6相對(duì)表達(dá)量高于子宮肌瘤組(P均<0.05)，Bax和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于子宮肌瘤組(P均<0.05)。

表2 兩組Survivin、Bcl-2、Bax、Beclin1、CDK4、CDK6相對(duì)表達(dá)量比較

注：與與子宮肌瘤組相比，#P<0.05。

2.3 子宮內(nèi)膜癌患者癌組織超聲造影參數(shù)和增殖、凋亡蛋白表達(dá)的相關(guān)性 子宮內(nèi)膜癌患者病灶Peak與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達(dá)量均呈正相關(guān)(r分別為0.704、0.692、0.737、0.730，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.687、-0.709，P均<0.05)；MTT與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達(dá)量均呈正相關(guān)(r分別為0.689、0.731、0.725、0.694，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.714、-0.698，P均<0.05)；TTP與病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.706、-0.725、-0.723、-0.701，P均<0.05)，與Bax和Beclin1蛋白表達(dá)量均呈正相關(guān)(r分別為-0.696、-0.719，P均<0.05)。

3 討論

由于子宮內(nèi)膜癌發(fā)病過程復(fù)雜，一旦確診，大部分患者多處于晚期，早期子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率接近90%，而30%的子宮內(nèi)膜癌患者多處于晚期，并且伴隨發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和深度侵襲，導(dǎo)致晚期子宮內(nèi)膜癌患者5年生存率僅16%～66%[10]。近年來，臨床上治療子宮內(nèi)膜癌的主要方式包括外科手術(shù)、放化療及激素聯(lián)合治療，這些治療方式均可以在一定程度上緩解病情，但是對(duì)合并轉(zhuǎn)移的患者這些方案的治療效果較差[2]。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，手術(shù)治療后早期患者預(yù)后較好，但是晚期患者的預(yù)后不佳，Ⅳ期患者5年生存率低，因此在術(shù)前進(jìn)行準(zhǔn)確的早期診斷有助于改善預(yù)后[11]。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展主要由細(xì)胞無限增殖和細(xì)胞凋亡不足導(dǎo)致的， 子宮內(nèi)膜癌患者病灶部位的新生血管很多，給腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲提供營養(yǎng)[11,12]。超聲造影是新近發(fā)展起來的無創(chuàng)性檢查手段，可以準(zhǔn)確有效地反映病灶部位的血流灌注情況，并且可以通過時(shí)間-強(qiáng)度曲線的相關(guān)參數(shù)反映病灶部位血供狀態(tài)[13]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組病灶Peak、MTT、TTP均高于子宮肌瘤組病灶，說明子宮內(nèi)膜癌患者病灶部位的血供豐富，血管阻力小，血流量大，呈現(xiàn)快進(jìn)快出的特點(diǎn)，達(dá)峰時(shí)間更短，峰值強(qiáng)度更大。

癌細(xì)胞增殖狀態(tài)是影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)展的重要因素，病灶部位新生的血管為腫瘤細(xì)胞的增殖提供營養(yǎng)，并且癌細(xì)胞增殖過程中受到多種基因的控制，CDK4和CDK6是其中重要的基因[14]。CDK4、CDK6與cyclin D1結(jié)合形成復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞周期的改變，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[12]。同時(shí)機(jī)體通過細(xì)胞凋亡消除衰老、受損的細(xì)胞，維持機(jī)體平衡，凋亡細(xì)胞的減少致使增生性疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡受到多種凋亡基因的調(diào)控[15]，Survivin作為抑制凋亡家族成員之一，定位于17q25，由142個(gè)氨基酸組成，分子量為16.5 kD，參與多種細(xì)胞凋亡程序，影響多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，當(dāng)Survivin表達(dá)水平異常升高時(shí)，不僅可以抑制凋亡，而且對(duì)于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、轉(zhuǎn)移及血管新生具有重要作用[16]。Survivin在多種惡性腫瘤中表達(dá)水平異常升高，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的診斷具有重要意義[17]。Survivin通過與細(xì)胞紡錘體微管上的微管蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而抑制細(xì)胞凋亡，微管是最強(qiáng)的抑制細(xì)胞凋亡因子，能夠通過特殊的結(jié)構(gòu)抑制蛋白效應(yīng)酶，從而阻滯細(xì)胞凋亡[17]。Bcl-2家族蛋白是影響細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，定位于18q21，參與細(xì)胞增殖和凋亡的平衡調(diào)節(jié)過程，主要是阻止細(xì)胞凋亡，減少腫瘤細(xì)胞的丟失量[18]。大量的Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其生存，誘發(fā)細(xì)胞異常積累和惡性轉(zhuǎn)化，子宮內(nèi)膜癌組織中Bcl-2的過度表達(dá)抑制細(xì)胞的程序性死亡，減緩細(xì)胞凋亡的速度，提高基因突變的概率，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展[17]。Bcl-2廣泛分布于多種生物體內(nèi)，其凋亡蛋白被凋亡相關(guān)因子被激活，轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，使得線粒體內(nèi)的促凋亡因子，并且逐級(jí)放大，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。Bax是Bcl-2家族蛋白中的促凋亡基因，基因定位于19q13.3～4，表達(dá)蛋白廣泛分布于組織器官中。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bax高度表達(dá)[19]。受到死亡信號(hào)刺激后，Bax從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與膜結(jié)合后形成同源二聚體，加速細(xì)胞凋亡，同時(shí)轉(zhuǎn)錄并編碼的蛋白質(zhì)促進(jìn)線粒體中的細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活Caspase家族介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，從而加速細(xì)胞凋亡[12]。自噬是Ⅱ型程序性死亡，在多個(gè)層面影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，如細(xì)胞周期和凋亡等，Beclin1是關(guān)于自噬的抑癌基因，定位于染色體17q21，是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)自噬相關(guān)基因，Beclin1表達(dá)水平升高，刺激自噬[20]。Beclin1控制自噬體的成熟，編碼的蛋白質(zhì)介導(dǎo)自噬過程，降解細(xì)胞內(nèi)的大分子和細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)定，另外Beclin1與Ⅲ型磷脂?；〈?3激酶形成的復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬過程[11]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組病灶組織Survivin、Bcl-2、CDK4、CDK6表達(dá)量高于子宮肌瘤組，Bax和Beclin1蛋白表達(dá)量低于子宮肌瘤組，說明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖速度加快，凋亡速度變慢，這與王瀚等[12]的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者病灶Peak、MTT、TTP與病灶組織CDK4、CDK6、Survivin、Bcl-2、Bax和Beclin1蛋白表達(dá)量密切相關(guān)，提示血流灌注能夠改變增殖、凋亡基因表達(dá)水平，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡密切相關(guān)，可以作為診斷子宮內(nèi)膜癌的重要手段之一。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌患者的超聲造影參數(shù)能夠反應(yīng)病變組織和周圍組織的血供情況，豐富的血供不僅上調(diào)增殖基因的表達(dá)，而且抑制凋亡基因的表達(dá)，超聲造影方法值得在臨床上推廣應(yīng)用。

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