不同劑量珍龍醒腦灌胃對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響及其機(jī)制

項(xiàng)穎卿，劉燕玲，章國(guó)良

(1江西科技學(xué)院，南昌 330098；2南昌市第二醫(yī)院)

血管性癡呆(VaD)是一種大腦血流減少引起的進(jìn)行性智力障礙疾病，是常見的老年性癡呆之一，嚴(yán)重影響患者認(rèn)知能力，尤其是執(zhí)行功能，是繼阿爾茨海默病后的第二大癡呆性疾病[1]。研究[2～5]顯示，某些藥物如乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基D-天冬氨酸受體抑制劑、磷酸二酯酶抑制藥等在VaD治療中起到一定的效果，但治療作用有限，且療效不確定[7]。中藥防治VaD的研究日益受到中醫(yī)藥研究者的重視，單味中藥或其有效成分防治VaD具有選擇性高、針對(duì)性強(qiáng)等特點(diǎn)[8]。珍龍醒腦主要含有珍珠、紫檀香、西紅花、訶子、塞北紫堇、冬葵果等幾十味名貴中藥成分，是治療缺血性腦血管疾病的經(jīng)典驗(yàn)方。珍龍醒腦能減少缺血腦組織梗死面積，抑制大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元凋亡，對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[9]；珍龍醒腦在促進(jìn)腦梗死患者的語(yǔ)言和肢體功能恢復(fù)，減輕腦梗死患者的后遺癥方面療效顯著[10]；但珍龍醒腦治療VaD的研究鮮有報(bào)道。目前認(rèn)為，VaD的發(fā)病機(jī)制可能與膽堿能環(huán)路傳導(dǎo)損傷、突觸可塑性病變、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[11]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路是一條經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛存在各種細(xì)胞中。本研究觀察了不同劑量珍龍醒腦灌胃對(duì)血管性癡呆(VaD)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠80只，3～4個(gè)月，體質(zhì)量(250±30)g，雌雄各半，由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)前將大鼠放置在Morris水池中行水迷宮定位航行測(cè)試(具體方法見行為學(xué)測(cè)試)，觀察記錄大鼠的搜索持續(xù)時(shí)間(逃避潛伏期)，每日訓(xùn)練1次，連續(xù)5 d。計(jì)算出大鼠逃避潛伏期的平均成績(jī)，以平均成績(jī)?yōu)閰⒄?，剔除不?huì)游泳、體質(zhì)弱及成績(jī)明顯低于平均值的大鼠。通過測(cè)評(píng)篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠50只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度25～26 ℃，每日光照12 h。

1.2 主要藥物與試劑 珍龍醒腦膠囊購(gòu)自青海金訶藏藥藥業(yè)股份有限公司，使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備混懸溶液配置成10 mg/mL的混懸液。PI3K、Akt兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、VaD模型制備及珍龍醒腦給予方法 SD大鼠稱重編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D、E組各10只。前4組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制作Vad模型，即大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，頸部用碘伏消毒，正中矢狀切口切開皮膚、皮下組織和筋膜，在雙側(cè)頸動(dòng)脈三角處鈍性分離迷走神經(jīng)，游離出頸總動(dòng)脈，取4號(hào)絲線結(jié)扎阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流，縫合切口；E組除不結(jié)扎阻斷頸總動(dòng)脈外，其余手術(shù)步驟均與前4組相同。術(shù)后各組均注射青霉素20萬(wàn)U預(yù)防感染。大鼠蘇醒后，A、B、C組分別以50、100、200 mg/kg珍龍醒腦灌胃，D、E組給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力評(píng)價(jià) 給藥4周后，各組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮主要由一個(gè)圓形水池和一個(gè)可移動(dòng)位置的平臺(tái)組成。水池直徑120 cm，高60 cm，平臺(tái)直徑12 cm。將清水注入到水池中至水深30 cm，平臺(tái)置于水面以下1 cm處。加入墨汁使池水變?yōu)椴煌该魃orris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為兩部分：①定位航行實(shí)驗(yàn)：按順時(shí)針方向依次由第一、二、三、四象限入水點(diǎn)順序，將受試大鼠頭面向池壁放入水中。記錄120 s內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果實(shí)驗(yàn)大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引上平臺(tái)并停留15 s，逃避潛伏期記錄為120 s。以大鼠4次逃避潛伏期的平均值作為其當(dāng)日的測(cè)評(píng)成績(jī)。連續(xù)測(cè)試5 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除原平臺(tái)，將各組大鼠取同一入水點(diǎn)(第二象限)放入水中，觀察并記錄大鼠60 s內(nèi)在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間百分比(停留時(shí)間百分比=停留時(shí)間/總游泳時(shí)間×100%)，計(jì)算跳臺(tái)穿越次數(shù)(60 s內(nèi)通過原平臺(tái)位置次數(shù)和)。

1.5 大鼠腦組織PI3K、Akt蛋白檢測(cè) 給藥4周后，各組另取4只大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，后快速斷頭，取腦組織，石蠟切片，脫蠟至水。依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用免疫組化法SP檢測(cè)腦組織PI3K、Akt蛋白。400倍鏡下觀察胞質(zhì)呈棕褐色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野，數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微攝影。采用IPP圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集，計(jì)數(shù)陰性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～5天逃避潛伏期比較 結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第1～5天逃避潛伏期比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第6天停留時(shí)間百分比、跳臺(tái)穿越次數(shù)比較 結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)第6天停留時(shí)間百分比、跳臺(tái)穿越次數(shù)比較

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織PI3-K、Akt蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見表3。

3 討論

VaD主要表現(xiàn)為記憶力、定向力、計(jì)算力等認(rèn)知功能的改變和情感行為異常，嚴(yán)重影響患者日常生活活動(dòng)能力、生活質(zhì)量及社會(huì)適應(yīng)能力[8,12]。研究[13]表明，VaD是目前惟一可防治的癡呆性疾病，早期干預(yù)有望使病情逆轉(zhuǎn)。西醫(yī)治療VaD的藥物主要有乙酰膽堿酯酶抑制劑(多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏)、N-甲基D-天冬氨酸受體抑制劑(美金剛)、磷酸二酯酶抑制劑(西洛他唑)、鈣拮抗劑(尼莫地平)等藥物的單用或聯(lián)用，但臨床治療效果有限，且療效不確定。中醫(yī)認(rèn)為，VaD多因年老體衰、腎精虧虛、痰濁阻竅、元神失聰所致，治療多從痰、瘀、虛論治，或化痰祛瘀、醒腦開竅，或補(bǔ)腎益精、活血通絡(luò)，或益氣養(yǎng)陰，生精填髓等，治療療效多滿意[14]。

表3 各組大鼠腦組織PI3-K、Akt蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)

注：與D組比較，*P<0.05；與A組比較，△P<0.05。

珍龍醒腦為傳統(tǒng)藏藥，始載于《四部醫(yī)典》，主要由珍珠、西紅花、冬葵果、紫檀香、余甘子、訶子、人工牛黃、木香、塞北紫堇、麝香、短穗兔耳草等中藥組成，具有養(yǎng)陰益氣、開竅醒神，瀉熱通絡(luò)、化痰、活血化瘀等功效[15]。多杰等[16]發(fā)現(xiàn)，珍龍醒腦在降低血液黏稠度、促使缺血腦組織側(cè)支循環(huán)暢通、改善腦部供血等方面療效顯著，有益于中風(fēng)后遺癥患者的恢復(fù)。雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(2VO)模型已成為經(jīng)典的研究VaD及評(píng)價(jià)藥物的重要?jiǎng)游锬Ｐ蚚17]。本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的認(rèn)知功能，結(jié)果顯示，與D組比較，A、B、C、E組實(shí)驗(yàn)第2～5天逃避潛伏期短；與A組比較，C組實(shí)驗(yàn)第2～5天逃避潛伏期短。與D組比較，A、B、C、E組實(shí)驗(yàn)第6天停留時(shí)間百分比高，B、C、E組跳臺(tái)穿越次數(shù)多；與A組比較，C組實(shí)驗(yàn)第6天留時(shí)間百分比高，B、C、E組跳臺(tái)穿越次數(shù)多。證實(shí)珍龍醒腦對(duì)VaD有神經(jīng)保護(hù)作用，且高劑量效果更佳。

PI3K/Akt信號(hào)通路廣泛存在各種細(xì)胞中，是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、代謝及抗細(xì)胞凋亡等作用[18]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的PI3K含量較少，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激物和生長(zhǎng)因子均可使PI3K活化，活化后的PI3K使肌醇環(huán)上3位的羥基磷酸化，進(jìn)而3，4-二磷酸磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PIP3作為第二信使再激活其下游蛋白發(fā)揮生物效應(yīng)。Akt又名蛋白激酶B，在靜息狀態(tài)細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于PI3K下游的直接靶蛋白。PI3K的激活將致Akt磷酸化，活化的Akt蛋白啟動(dòng)通路下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化和純化其下游底物，通過多種途徑發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞存活、抗細(xì)胞凋亡的作用。本課題的前期研究表明，珍龍醒腦膠囊能通過上調(diào)Bcl-2、抑制Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[9]，但對(duì)其上游信號(hào)通路未做探討。本研究顯示，與D組比較，B組和C組PI3K、Akt蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，E組PI3K、Akt蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少；與A組比較，B組和C組PI3K、Akt蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加。表明珍龍醒腦膠囊可以通過增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的活化效應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，此結(jié)果可為珍龍醒腦在防治VaD方面提供客觀的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。但由于本實(shí)驗(yàn)未涉及到PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑及其下游靶基因mTOR相關(guān)的神經(jīng)元自噬作用的研究，具有一定局限性，有待在今后的實(shí)驗(yàn)研究中得到進(jìn)一步完善。

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