S100A6基因作用對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖遷移能力的影響及其機(jī)制

姚月榮，劉富群

(1盤(pán)錦職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧盤(pán)錦124010；2盤(pán)錦市中心醫(yī)院)

S100蛋白家族屬于鈣結(jié)合蛋白超家族，與鈣離子結(jié)合發(fā)生構(gòu)象改變暴露結(jié)合位點(diǎn)后，與靶蛋白結(jié)合并相互作用，在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮作用[1～4]。S100A6蛋白屬于S100蛋白家族的A家族，作為細(xì)胞內(nèi)蛋白，S100A6參與細(xì)胞內(nèi)多種生理病理過(guò)程，如增殖、凋亡以及細(xì)胞對(duì)各種細(xì)胞因子的應(yīng)答等。S100A6在不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平并不一致，在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤中，S100A6的表達(dá)是升高的，而在前列腺癌和口腔癌中S100A6的表達(dá)是降低的[5]。譚媛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中S100A6表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)量與宮頸癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但關(guān)于S100A6在宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移過(guò)程中發(fā)揮的作用及其機(jī)制，目前少有報(bào)道。本研究用轉(zhuǎn)染S100A6真核表達(dá)載體的方法上調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞S100A6表達(dá)，用轉(zhuǎn)染S100A6小干擾RNA(siRNA)的方法下調(diào)宮頸癌CaSki細(xì)胞S100A6表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力的變化，以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探討上調(diào)或者下調(diào)宮頸癌細(xì)胞S100A6表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力產(chǎn)生影響的機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系Hela、CaSki購(gòu)自上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中(含10% FBS、10×104U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。3～4 d傳代一次，傳代比例為1∶3；取復(fù)蘇后第4～10代的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞分組及S100A6過(guò)表達(dá)載體、S100A6 siRNA轉(zhuǎn)染 從GeneBank中調(diào)取S100A6基因的編碼區(qū)(CDS)堿基序列(NM_014624.3)，PCR擴(kuò)增，經(jīng)BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切、PCR和測(cè)序鑒定，構(gòu)建pcDNA3.0-S100A6真核表達(dá)載體。將Hela細(xì)胞接種于6孔板，設(shè)觀察1組、對(duì)照1組及空白1組。觀察1組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-S100A6真核表達(dá)載體，對(duì)照1組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染試劑均為脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo公司)，空白1組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)間為24 h。將CaSki細(xì)胞分為觀察2組、對(duì)照2組及空白2組。觀察2組轉(zhuǎn)染S100A6 siRNA，序列5′-GUGGCCAUCUUCCACAAGUTT-3′，對(duì)照2組轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列，轉(zhuǎn)染試劑均為脂質(zhì)體Lipofectamine 3000(美國(guó)Thermo公司)，空白2組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)間為24 h。

1.3 各組細(xì)胞S100A6 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集各組細(xì)胞并用胰酶消化，加入1 mL Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)抽提細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物置于-20oC保存?zhèn)溆?。S100A6、內(nèi)參GAPDH的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列由南京金斯瑞生物科技公司合成。S100A6正向序列5′-ATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3′，反向序列5′-TCAGCCCTTGAGGGCTTCAT-3′；GAPDH正向序列5′-CAGCGACACCCACTCCTC-3′，反向序列5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′。用定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500，美國(guó)ABI公司)進(jìn)行擴(kuò)增并定量檢測(cè)S100A6mRNA表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系為10 μL，反應(yīng)條件：50 ℃ 2min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 于24孔板中放置Transwell小室，在24孔板下室中加入500 μL含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液，Transwell小室中加入100 μL各組細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)約1×105個(gè))；48 h后去除24孔板下室中的培養(yǎng)液，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，室溫放置5 min后顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，記錄每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞EMT、PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞2～5×105個(gè)，加入RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)抽提細(xì)胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo公司)檢測(cè)蛋白濃度。10% SDS-PAGE膠電泳分加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBS-T洗膜后，分別加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔或者兔抗鼠二抗(上海玉博生物科技有限公司，1∶10 000稀釋),室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，用凝膠成像儀(GelDoc-It，美國(guó)UVP公司)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行觀察獲取圖像，并對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析(Image Lab軟件)。EMT相關(guān)蛋白檢測(cè)E-cadherin蛋白和N-cadherin蛋白。PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)p-AKT、t-AKT及下游Snail、Twist蛋白。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞增殖情況觀察 將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種(0.8～1.0)×104個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。棄去上清，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD450)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 轉(zhuǎn)染24 h觀察1組、對(duì)照1組、空白1組Hela細(xì)胞S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.87±0.86、1.04±0.08、0.97±0.11，觀察1組Hela細(xì)胞S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照1組和空白1組相比，P均<0.05；觀察2組、對(duì)照2組、空白2組CaSki細(xì)胞S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.43±0.07、1.12±0.09、0.98±0.12，觀察2組CaSki細(xì)胞S100A6 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照2組和空白2組相比，P均<0.05。

2.2 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染24 h行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察1組、對(duì)照1組、空白1組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(48.26±4.89)、(21.31±4.27)、(20.12±6.23)個(gè)，觀察1組穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照1組和空白1組相比，P均<0.05；觀察2組、對(duì)照2組、空白2組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(81.36±8.33)、(147.49±6.98)、(142.23±9.16)個(gè)，觀察2組穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照2組和空白2組相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量比較 觀察1組、對(duì)照1組、空白1組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量見(jiàn)表1，觀察2組、對(duì)照2組、空白2組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量見(jiàn)表2。與對(duì)照1組和空白1組相比，觀察1組Hela細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量較低(P均<0.05)，N-cadherin、p-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量較高(P均<0.05)，但三組t-AKT蛋白表達(dá)量相比P均>0.05；與對(duì)照2組和空白2組相比，觀察2組CaSki細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)量較高(P均<0.05)，N-cadherin、p-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量較低(P均<0.05)，但三組t-AKT蛋白表達(dá)量相比P均>0.05。

表1 轉(zhuǎn)染24 h后觀察1組、對(duì)照1組、空白1組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量比較

注：與對(duì)照1組和空白1組相比，*P<0.05。

表2 轉(zhuǎn)染24 h后觀察2組、對(duì)照2組、空白2組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、p-AKT、t-AKT、Snail、Twist蛋白表達(dá)量比較

注：與對(duì)照2組和空白2組相比，*P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后OD450比較 轉(zhuǎn)染24 h后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，觀察1組、對(duì)照1組、空白1組Hela細(xì)胞OD450相比P均>0.05；繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察1組Hela細(xì)胞OD450高于空載體組和空白對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表3。轉(zhuǎn)染24 h后繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，觀察2組、對(duì)照2組、空白2組CaSki細(xì)胞OD450相比，P均>0.05。繼續(xù)培養(yǎng)72 h,觀察2組CaSki細(xì)胞OD450低于對(duì)照2組和空白2組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表4。

表3 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h觀察1組、對(duì)照1組、空白1組OD450比較

注：與對(duì)照1組、空白1組相比，*P<0.05。

表4 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h觀察2組、對(duì)照2組、空白2組OD450比較

注：與對(duì)照2組、空白2組相比，*P<0.05。

3 討論

S100A6基因定位于染色體1q21，是腫瘤細(xì)胞中頻繁出現(xiàn)染色質(zhì)重組的位點(diǎn)。S100A6基因最早發(fā)現(xiàn)于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的成纖維細(xì)胞中，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如參與細(xì)胞增殖凋亡調(diào)控、調(diào)節(jié)酶活性、調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化和維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等[7]。

在心肌疾病[8]和多種腫瘤細(xì)胞中，S100A6表達(dá)是升高的，但是導(dǎo)致S100A6升高的原因并沒(méi)有被完全闡明。多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與調(diào)節(jié)S100A6基因啟動(dòng)子活性[9, 10]。在胰腺癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和肝癌中，S100A6常常被用作診斷和預(yù)后的生物學(xué)分子。在甲狀腺癌中，S100A6表達(dá)增加并且在乳突型甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[11]。宮頸癌細(xì)胞中S100A6在Hela細(xì)胞中低表達(dá)，而在CaSki細(xì)胞中高表達(dá)。故本研究選用Hela細(xì)胞觀察過(guò)表達(dá)S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響，選用CaSki細(xì)胞細(xì)胞觀察沉默S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，在Hela細(xì)胞中過(guò)量S100A6蛋白后，能夠增強(qiáng)Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力；采用siRNA片段干擾CaSki細(xì)胞中S100A6基因表達(dá)，可以使細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均下降。表明S100A6蛋白參與了宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控。

近年來(lái)的研究證實(shí)，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和分子機(jī)制，包括鈣連接素、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、生長(zhǎng)因子、微環(huán)境等。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的典型特點(diǎn)是上皮細(xì)胞表型缺失，其上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)降低，失去極性，并且表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特性，同時(shí)間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin表達(dá)增加。本研究中結(jié)果顯示，使用S100A6真核表達(dá)質(zhì)粒使Hela細(xì)胞中S100A6蛋白表達(dá)增加后，細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)下降、N-cadherin表達(dá)增加。通過(guò)轉(zhuǎn)染S100A6 siRNA降低CaSki細(xì)胞中S100A6基因表達(dá)后，細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增加、N-cadherin表達(dá)下降，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在宮頸癌細(xì)胞中S100A6基因表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

有關(guān)S100A6參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究較多。在胃癌細(xì)胞中，S100A6能夠通過(guò)干擾β-catenin的蛋白降解過(guò)程，負(fù)調(diào)控CacyBP/SIP介導(dǎo)的抑制細(xì)胞增殖和腫瘤形成作用，進(jìn)而促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展[13]，此外，S100A6能夠促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞遷移和侵襲，并且通過(guò)激活β-catenin促進(jìn)EMT[14]。在腎臟細(xì)胞癌中，S100A6表達(dá)增加后能夠抑制抗腫瘤趨化因子CXCL14的表達(dá)以及CXCL14誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞存活[15]。陸文銓等[16]采用基因沉默技術(shù)干擾食管癌細(xì)胞Eca109中S100A6基因表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性和遷移能力均明顯被抑制。在人骨肉瘤細(xì)胞143B中，有學(xué)者用重組人S100A6蛋白(rhS100A6)與PI3K抑制劑(LY294002和wortmannin)單獨(dú)或者同時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)rhS100A6能顯著增強(qiáng)143B細(xì)胞的增殖和遷移能力，而PI3K抑制劑則能夠部分逆轉(zhuǎn)此效果，證實(shí)S100A6促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞143B增殖和遷移的作用，至少部分是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，在Hela細(xì)胞中增加S100A6蛋白表達(dá)后，細(xì)胞中的p-Akt蛋白表達(dá)量也顯著增加。Akt磷酸化是激活PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟。這說(shuō)明S100A6能夠激活宮頸癌細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路。本研究還發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路的下游靶基因Snail和Twist的蛋白表達(dá)水平也有不同程度的升高；下調(diào)CaSki細(xì)胞中S100A6表達(dá)后，各蛋白表達(dá)量變化向相反方向進(jìn)行。這進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt信號(hào)通路在S100A6過(guò)量表達(dá)后被激活。。

綜上所述，S100A6能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程，這可能是可能是通過(guò)激活細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞EMT實(shí)現(xiàn)的。這為進(jìn)一步闡明S100A6在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。S100A6有可能是宮頸癌診斷和治療的潛在靶標(biāo)。

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