醛酮還原酶家族1成員B10過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞株Hela增殖、周期、侵襲和遷移觀察

曾元清，李佳，胡政，羅偉濠，王晴美,羅迪賢，

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515；2郴州市第一人民醫(yī)院)

宮頸癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是宮頸癌致死的主要原因之一，在宮頸癌的轉(zhuǎn)移侵襲中，許多蛋白起重要作用[1,2]。醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10)通過(guò)抑制乙酰輔酶A羧化酶α(ACCα)降解調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)代謝，進(jìn)而調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖[3, 4]。宮頸癌 Hela細(xì)胞正常情況不表達(dá)AKR1B10，AKR1B10過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響尚不明確。本研究觀察了AKR1B10過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌 Hela細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移的影響，探討將AKR1B10作為預(yù)防宮頸癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移靶標(biāo)的可能性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 材料 Hela細(xì)胞株(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng))，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific美國(guó))；倒置顯微鏡(Leica美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter 美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 美國(guó))；Transwell(Corning 美國(guó))；MTT試劑盒(碧云天公司)；凋亡試劑盒(碧云天公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋)；HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋)；MMP-2抗體(Abcam美國(guó))、Vimentin抗體(Abcam美國(guó))、β-actin(Abcam美國(guó))、AKR1B10抗體(實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.2 細(xì)胞分組及AKR1B10過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將AKR1B10 cDNA序列克隆到慢病毒表達(dá)載體pSIN-EF2-Sox2-Pur(以下簡(jiǎn)稱(chēng)pSIN-EF2)中，構(gòu)建慢病毒載體pSIN-EF2/AKR1B10。用LipofectamineTM2000將表達(dá)載體pSIN-EF2/AKR1B10、包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，制備高滴度慢病毒載體系統(tǒng)。用pSIN-EF2/AKR1B10慢病毒載體系統(tǒng)感染Hela細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)AKR1B10的細(xì)胞株Hela/AKR1B10，為觀察組。將pcDNA3.1(-)克隆到慢病毒表達(dá)載體pSIN-EF2-Sox2-Pur中，構(gòu)建慢病毒載體pSIN-EF2/Vector，用LipofectamineTM2000將表達(dá)載體pSIN-EF2/Vector、包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，制備高滴度慢病毒載體系統(tǒng)。用pSIN-EF2/Vector慢病毒載體系統(tǒng)感染Hela細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定的細(xì)胞株Hela/Vector，取Hela/Vector細(xì)胞為對(duì)照組。

1.3 兩組細(xì)胞增殖情況觀察

1.3.1 MTT法 接種兩組各5×103個(gè)對(duì)數(shù)期細(xì)胞于96孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24、48、72 h，然后每孔加入10 μL的MTT 溶液(5 mg/mL)避光繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸掉上清，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，溶解結(jié)晶。用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值(OD570)，每組細(xì)胞設(shè)平行孔6個(gè)，取平均值。

1.3.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期兩組細(xì)胞以每孔200個(gè)細(xì)胞密度分別接種于6孔板中，每隔3天換培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)2周。棄培養(yǎng)基，用PBS洗2次，用1 mL 4%多聚甲醛固定，然后用PBS洗2次，加1 mL的 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染液，空氣干燥。觀察兩組細(xì)胞集落的大小和數(shù)量。

1.4 兩組細(xì)胞周期分別檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)期兩組細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃過(guò)夜，離心收集細(xì)胞，以1 mL的PBS洗一次，加入500 μL的PBS洗細(xì)胞一次，加入含50 μg/mL溴化乙錠(PI)、100 μg/mL RNase A的PBS共500 μL，4 ℃孵育30 min，用流式細(xì)胞儀和Modfit軟件測(cè)算細(xì)胞周期分布。

1.5 兩組細(xì)胞遷移情況觀察 接種兩組細(xì)胞各1×105個(gè)于24孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，用200 μL移液槍頭劃痕，PBS洗細(xì)胞3次洗去劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，拍照，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后再拍照1次。計(jì)算劃痕愈合百分比。劃痕愈合百分比=1-培養(yǎng)24小時(shí)劃痕面積/開(kāi)始的劃痕面積×100%。

1.6 兩組細(xì)胞侵襲情況觀察 將Matrigel膠以無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋?zhuān)總€(gè)Transwell上室加入100 μL。取對(duì)數(shù)期兩組細(xì)胞按每孔100 μL無(wú)血清細(xì)胞懸液(1×105個(gè))加入Transwell上室，同時(shí)在Transwell下室加入500 μL含10%FBS培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后取出，吸去Transwell上室多余液體，用PBS清洗兩次，用棉簽在上室中輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，吸干水分并擦去膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。在上室加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min，在上室加入500 μL的0.1%結(jié)晶紫染色15 min，吸去染色液，PBS洗3次，晾干后用顯微鏡觀察、拍照，并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 兩組AKR1B10、p53、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、波形蛋白(Vimentin)檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)期兩組細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)到細(xì)胞密度80%左右，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜1.5 h，然后用5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，第二天加二抗在室溫孵育1.5 h，顯影拍照。以β-actin為內(nèi)參照。目的蛋白表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞AKR1B10蛋白表達(dá)量比較 觀察組、對(duì)照組細(xì)胞AKR1B10蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.04、0，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖情況比較 MTT法測(cè)得繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h各組細(xì)胞OD570見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h觀察組細(xì)胞OD570均低于對(duì)照組(P均<0.05)。克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)得觀察組、對(duì)照組形成克隆個(gè)數(shù)分別為(125.2±5.3)、(174.7±6.0)個(gè)，兩組相比，P<0.05。

表1 繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h兩組細(xì)胞OD570比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞周期分布比較 各組細(xì)胞周期分布見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，觀察組G0～G1期細(xì)胞比例上升(P<0.05)，G2～M期和S期細(xì)胞比例下降(P均<0.05)。

表2 兩組細(xì)胞周期分布比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.4 兩組劃痕愈合百分比比較 觀察組、對(duì)照組劃痕愈合百分比為8.94%±2.09%、21.62%±1.44%，兩組相比，P<0.05。

2.5 兩組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 觀察組、對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(29.2±2.0)、(57.0±3.2)個(gè)，兩組相比，P<0.05。

2.6 兩組細(xì)胞p53、MMP-2、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 兩組細(xì)胞p53、MMP-2、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表3。觀察組p53蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05)，MMP-2、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組(P均<0.05)。

表3 兩組細(xì)胞p53、MMP-2、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

AKR1B10又叫醛糖還原酶相似蛋白(aARL-1)，其編碼基因定位于染色體7q33區(qū)域，編碼一個(gè)由316個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)[5]。AKR1B10不僅通過(guò)穩(wěn)定乙酰輔酶A羧化酶α,抑制其降解，調(diào)控細(xì)胞脂質(zhì)代謝和腫瘤細(xì)胞增殖，也可以通過(guò)還原羰基化合物，減少細(xì)胞變性，抑制腫瘤的發(fā)生，延緩腫瘤的發(fā)展[6]。AKR1B10在正常胃腸道上皮組織中高表達(dá)，其他正常組織低表達(dá)或者不表達(dá)；在乳腺癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，但在胃腸道腫瘤如胃癌、食管癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中低表達(dá)或者不表達(dá)[6～11]。因此，AKR1B10是潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

Hela細(xì)胞系是被人乳頭瘤病毒(HPV)18型轉(zhuǎn)化的。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，觀察組過(guò)表達(dá)AKR1B10的Hela細(xì)胞OD570較低，克隆形成實(shí)驗(yàn)克隆形成數(shù)量較少，說(shuō)明細(xì)胞增殖受到明顯抑制。觀察組過(guò)表達(dá)AKR1B10的Hela細(xì)胞中G0～G1期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，說(shuō)明觀察組Hela細(xì)胞被阻滯于G0～G1期，這可能是觀察組細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組的直接原因。

HPV感染是導(dǎo)致女性宮頸癌發(fā)生的主要原因，超過(guò) 80% 的宮頸癌與 HPV 感染密切相關(guān)。HPV早期基因編碼的產(chǎn)物中，E6 蛋白具有高度致癌性[12, 13]。 正常情況下，p53 蛋白經(jīng)泛素化降解途徑進(jìn)行降解。HPV 感染導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞中，野生型p53 蛋白的降解主要由 E6 蛋白介導(dǎo)，E6 蛋白與 E6-AP 結(jié)合形成復(fù)合體( E6 /E6-AP) ，通過(guò)該復(fù)合體，p53 與活化的泛素連接，從而被降解[14～18]。p53快速降解而失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的正常調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖的惡性行為[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組過(guò)表達(dá)AKR1B10的Hela細(xì)胞中p53水平高于對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)AKR1B10可以提高宮頸癌Hela細(xì)胞中p53水平，恢復(fù)p53對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的正常調(diào)控，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的惡性增殖，這可能是觀察組細(xì)胞增殖活性低于對(duì)照組的原因之一。

本研究結(jié)果顯示，觀察組過(guò)表達(dá)AKR1B10的Hela細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)劃痕愈合百分比低于對(duì)照組，侵襲實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組，表明觀察組過(guò)表達(dá)AKR1B10的Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力低于對(duì)照組。為探究其機(jī)制，本研究檢測(cè)了兩組細(xì)胞中MMP-2、Vimentin蛋白的表達(dá)。Vimentin調(diào)節(jié)蛋白骨架蛋白、細(xì)胞黏附分子等蛋白間的相互作用，參與腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的黏附、遷移、侵襲和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[19, 20]。MMP-2能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組MMP-2、Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，表明AKR1B10可能通過(guò)MMP-2和Vimentin途徑調(diào)控宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和遷移。綜上所述，AKR1B10在宮頸癌HeLa細(xì)胞異常增殖的過(guò)程當(dāng)中扮演著負(fù)相調(diào)控作用。AKR1B10過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，阻滯細(xì)胞周期于G0、G1期。AKR1B10可能是預(yù)防宮頸癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移的作用靶標(biāo)。

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