以甘油為碳源生產(chǎn)細菌纖維素條件優(yōu)化

馬春華，辜文彥，王依靜

（武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300）

細菌纖維素（bacterial cellulose，簡稱BC）是由各種類型的細菌合成的，在材料、造紙、醫(yī)藥及食品領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[1-3]。與天然纖維素相比，細菌纖維素具有高持水性、高機械強度、良好生物相容性等獨特性能[4],但其發(fā)酵工藝落后、產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高一直是限制其應(yīng)用于高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)的瓶頸[5]。在細菌纖維素的研究上，多集中在原料的利用、菌種的選育上[6]及發(fā)酵條件的優(yōu)化[7]等。馬霞等[8]以酒糟浸出液發(fā)酵產(chǎn)細菌纖維素，研究出最優(yōu)的培養(yǎng)基配；Cheng等[9]以水解玉米桿為碳源，綠色合成細菌纖維素；還有研究用豆渣制備BC[10]。

能夠產(chǎn)生纖維素的微生物主要有9個屬，但真正能夠大批量生產(chǎn)細菌纖維素的只有醋酸菌屬中的幾個種，特別是醋酸菌屬中的木醋桿菌，已成為生產(chǎn)BC的模式菌株[11]。

近年來，由于能源緊缺及各國從環(huán)境保護和資源戰(zhàn)略的角度出發(fā)，生質(zhì)柴油發(fā)展迅速，甘油作為在生質(zhì)柴油的煉制過程中含量最高的副產(chǎn)物（約為甘油量的10%），因生產(chǎn)過剩而價格下跌，開發(fā)甘油的新工業(yè)用途，意義重大。

有鑒于此，本研究利用木醋桿菌，以甘油為主要原料合成細菌纖維素，將可提升生質(zhì)柴油制程中的附產(chǎn)品甘油的利用率，將其轉(zhuǎn)化成高附加值的產(chǎn)品——細菌纖維素。并開發(fā)A4尺寸大小的細菌纖維素，可以作為面膜裁剪原料，為細菌纖維素的開發(fā)利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：木醋桿菌（Acetobacter xylinum）購自上海谷研生物；甘油，工業(yè)級，維之城化工有限公司。

1.2 試驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75SII）上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫培養(yǎng)箱（DRP-9162）上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet is5），Thermo Fisher。

1.3 培養(yǎng)基配方

斜面菌種培養(yǎng)基：葡萄糖 5%，蛋白胨0.5%，酵母膏 0.5%，檸檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%，瓊脂 2%。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%， 檸檬酸 0.1%，Na2HPO4·12H2O 0.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.025%。

液態(tài)培養(yǎng)基：甘油（或葡萄糖）2%、酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，檸檬酸0.5%，Na2HPO4·12H2O 0.5%。

所有培養(yǎng)基121℃滅菌20 min。

1.4 三步發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.4.1 一級種子震蕩培養(yǎng)

取1環(huán)活化好的斜面種子接入150 mL種子培養(yǎng)基，充分振蕩，30℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.4.2 二級種子擴大培養(yǎng)

取振蕩培養(yǎng)后的種子培養(yǎng)基，以10%接種量接入相同體積的新種子培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)20 h。

1.4.3 靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

取二級種子10%接種量接入盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，30℃靜置培養(yǎng)7 d。

1.5 細菌纖維素的制備

按照上述發(fā)酵培養(yǎng)基的濃度配制液態(tài)培養(yǎng)基置于250 ml三角錐形瓶中，用矽膠塞將瓶口塞緊，滅菌。待降溫降壓后，無菌操作，接種種子液，充分搖動，使菌落分散均勻，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細菌纖維素膜形成后取出。A4尺寸細菌纖維素，選用不銹鋼、玻璃、塑料為材料的容器。

1.6 細菌纖維素的處理

從培養(yǎng)容器中取出細菌纖維素膜，用蒸餾水多次沖洗除去膜表面雜質(zhì)，直至細菌纖維素膜呈白色半透明狀，再用去離子水反復(fù)沖洗至中性，經(jīng)冷凍干燥36 h后稱重。纖維素產(chǎn)量表示為g（纖維素/干重）/L（培養(yǎng)液）。

1.7 細菌纖維素鑒定

利用傅里葉紅外光譜分析所得產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 接種量對BC合成的影響

按2%、4%、6%、8%、10% 的接種量，30℃培養(yǎng) 7 d。如圖1所示：不論是以葡萄糖或甘油為碳源，當(dāng)接種量在2%～6%時，隨著接種量的不斷增加，BC的合成逐漸增多，當(dāng)接種量為6%時，BC的產(chǎn)量最高。接種量超6%以后，細菌纖維素的產(chǎn)量下降，相同條件下，甘油比葡萄糖合成更多的BC。這是因為木醋桿菌為嚴(yán)格好氧菌，在接種量較高的情況下，木醋桿菌數(shù)量多，對氧氣的需要量就大，但發(fā)酵液的溶氧條件有限，導(dǎo)致細菌因供氧不足影響到BC的合成[12]。接種量也影響培養(yǎng)周期，種子溶液濃度高時，培養(yǎng)周期可以縮短，尤其是延遲期；當(dāng)接種量太高的時候，往往會導(dǎo)致培養(yǎng)基中的底物在早期消耗過快，不利于后期細菌生長代謝產(chǎn)物的累積[13]。

圖1 接種量對發(fā)酵的影響Figure 1 Effect of inoculation amount on fermentation

2.2 甘油濃度對BC合成的影響

甘油濃度為1%、1.5%、2%、2.5%和3%，接種量為6%，30℃培養(yǎng)7 d，甘油濃度對BC合成的影響如圖2所示：當(dāng)甘油濃度在2%時，BC的合成量為5.2 g·L-1，繼續(xù)增加甘油濃度時，產(chǎn)量略有下降，合成BC最適生產(chǎn)的甘油濃度為2%。

圖2 甘油的濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Figure 2 Effects of concentration of glycerol on the yield of bacterial cellulose

2.3 培養(yǎng)時間對BC合成的的影響

在培養(yǎng)溫度為30℃，甘油濃度為2%，接種量為6% 的條件下，考察 4、5、6、7、8 d，對細菌纖維素合成量的影響。結(jié)果如圖3所示，最佳發(fā)酵時間為7 d,呂鴻皓[14]等木醋桿菌利用大豆糖蜜為原料生產(chǎn)BC，最佳發(fā)酵時間為6 d。

圖3 發(fā)酵時間對細菌纖維素產(chǎn)量的影響Figure 3 Effects of fermentation time on cellulose production

2.4 A4生物細菌纖維素膜的制備

2.4.1 培養(yǎng)模具的選擇

選用不同材料的模具，進行A4大小BC膜的制備，結(jié)果如表1所示，以不銹鋼材料的最好，BC膜表面光滑平整，呈乳白色，如圖4，這個尺寸的BC膜可用作面膜材料。

表1 不同材質(zhì)培養(yǎng)器具對細菌纖維素外觀形態(tài)的影響Table 1 Effects of container material on the appearance of bacterial cellulose

圖4 A4大小細菌纖維素Figure 4 A4 size of bacterial cellulose

2.5 紅外光譜分析

從圖5可以看到在3 346 cm-1處有一個強且寬的-OH振動伸縮峰，2 901 cm-1處是-CH的伸縮振動峰，1 643 cm-1處是4半縮醛基團的吸收峰，1 315 cm-1代表C-H的伸縮振動，1 059 cm-1代表C-O-C的伸縮振動[14-15]，這些基團與纖維素的分子結(jié)構(gòu)式中所包含的有機化合物基團基本吻合。

圖5 細菌纖維素紅外光譜圖Figure 5 Infrared spectrum of bacterial cellulose

3 結(jié)論

本試驗的結(jié)果表明：工業(yè)甘油適合做木醋桿菌發(fā)酵的基本培養(yǎng)基制備細菌纖維素，其發(fā)酵最佳條件為：甘油量2%、接種量 6%、30℃ 靜態(tài)培養(yǎng)7 d，細菌纖維素的產(chǎn)量高達5.4 g·L-1。A4尺寸大小的細菌纖維素薄膜制備以不銹鋼盆作為模具效果最好。