NLRs炎癥體在肺感染性疾病中的作用機(jī)制研究※

夏金嬋 張小莉

肺感染性疾病是臨床上常見的疾病，包括終末氣道、肺泡腔及肺間質(zhì)等在內(nèi)的肺實(shí)質(zhì)炎癥。世界衛(wèi)生組織（WHO）資料顯示2004年的發(fā)病率為4.29億，成為全球第三大致死疾病。慢性阻塞性肺炎（COPD）主要是由于煙草煙霧與細(xì)菌感染引起，在許多農(nóng)業(yè)國家是第四大致死原因。急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是有多種非心源性治病因素，例如，感染導(dǎo)致的毛細(xì)血管通透性增高的急性進(jìn)行性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭[1]。過敏性哮喘是由于過敏引起的氣道炎癥，導(dǎo)致慢性周期性的氣道阻塞。長(zhǎng)期暴露在二氧化硅、石棉或煤顆?？蓪?dǎo)致慢性職業(yè)病塵肺。固有免疫又稱非特異性免疫，是機(jī)體防御病原菌入侵的第一道防線，在肺感染性疾病中起重要的作用[2]。模式識(shí)別受體 （patter-recognition receptors，PRRs）是固有免疫受體的代表，包含不同的蛋白家族，例如，Toll樣受體 （Toll-like receptors，TLRs） 定位在膜上和NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptors，NLRs） 定位在胞質(zhì)[3]。PRRs與病原微生物表面的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）識(shí)別和相互作用后活化下游信號(hào)通路，引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答。最近的研究證明破壞宿主細(xì)胞的完整性與危險(xiǎn)信號(hào)在免疫系統(tǒng)阻止病原菌的入侵方面也具有重要的意義。PRRs還可以與損傷相關(guān)分子模式（Damage-associated molecular patterns，DAMPs） 識(shí)別和相互作用參與無菌組織的損傷過程[4]。而且，一些PRRs還能對(duì)大顆粒物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，在塵肺病中是一個(gè)關(guān)鍵的炎癥因子[5]。細(xì)胞因子、炎癥趨化因子和黏附分子分泌失調(diào)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了肺感染性疾病的發(fā)展。NLRs家族在人類中包含22個(gè)成員，在小鼠中更多，其結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)為：C末端為亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域（leucine-rich repeat，LRR），具有識(shí)別配體與自我調(diào)節(jié)功能；中間為NOD，可以發(fā)生自身的寡聚；N末端為可變的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，可為胱冬蛋白的募集域 （caspaserecruitment domain，CARD）、pyrin的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 （pyrin effector domain，PYD） 及細(xì)胞凋亡桿狀病毒抑制蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat domain，BIR）。具有調(diào)節(jié)同型蛋白相互作用的功能，在某種程度上影響調(diào)節(jié)因子的結(jié)合及下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。NLRs根據(jù)N端結(jié)構(gòu)域的不同可以分為四個(gè)亞家族，NLRA含有反式激活子激活域 （ADs），NLRB含有BIR結(jié)構(gòu)域，NLRC含有CARD，NLRP含有PYD[6]。本文就NLRs炎性體在肺感染性疾病中作用的相關(guān)研究進(jìn)展做如下綜述。

1 NOD1和NOD2

NOD1和NOD2是NLRs家族第一個(gè)被研究證明參與對(duì)病原菌感知的胞內(nèi)蛋白，編碼NOD1和NOD2的基因分別位于人類染色體7p14和16p12，在其N末端都含有CARD結(jié)構(gòu)域。NOD1在許多組織與細(xì)胞中都有表達(dá)，例如：?jiǎn)魏思?xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞，NOD1只在一些細(xì)胞中表達(dá)，例如：樹突狀細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞。NOD1和NOD2在結(jié)構(gòu)上的不同主要體現(xiàn)在前者只有一個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，后者有兩個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，都參與結(jié)合下游效應(yīng)分子，活化核因子κβ（nuclear factor-κB，NF-κB），任何一個(gè)缺失都會(huì)影響NOD2蛋白的功能。NF-κB是天然免疫系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。能夠調(diào)節(jié)許多炎癥因子的表達(dá)，在機(jī)體抗感染過程中發(fā)揮著重要的作用。NOD受體的配體是細(xì)菌的肽聚糖，主要是N-乙酰葡糖胺 （GlcNAc，G） 和N-乙酰胞壁酸（MurNAc，M）通過短肽相互連接交替形成，在大多數(shù)革蘭氏陰性與革蘭氏陽性菌中NOD1識(shí)別m-DAP（LAla-g-D-Glum-diaminopimelic acid），而NOD2識(shí)別MDP（muramyl dipeptide）[7]。雖然NOD1和NOD2識(shí)別的配體結(jié)構(gòu)不同，但是配體的結(jié)合都能使NOD1和NOD2蛋白中部的NOD結(jié)構(gòu)域自身寡聚化形成受體復(fù)合體，受體復(fù)合體通過CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用招募胞質(zhì)的銜接分子受體作用蛋白-2（receptor-interacting protein-2，RIP2），泛素化的RIP2激活NF-κB。IκB激酶 （IκB kinase，IKK）復(fù)合體也參與了這一過程，IKK激酶復(fù)合體是由α、β、γ三個(gè)亞基組成，前兩個(gè)為催化亞基，后一個(gè)為調(diào)節(jié)亞基，RIP2與IKKγ亞基作用激活I(lǐng)KK復(fù)合物，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄活性，參與天然免疫反應(yīng)[8]。另外，在細(xì)胞內(nèi)NOD1還能夠活化胱冬蛋白-9（caspase-9）前體，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)[9]。

NLRs在識(shí)別病原菌誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子在病菌感染過程中起著重要的作用（圖1）。研究表明敲除NOD1、NOD2或RIP2基因的小鼠感染衣原體（C.pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（S.aureus） 或嗜肺軍團(tuán)菌（L.pneumophila）時(shí)肺部細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)量減少，并且影響嗜中性粒細(xì)胞的向肺部的招募過程[10]。感染敲除NOD1、NOD2或RIP2基因的小鼠清除衣原體感染的能力降低，金黃色葡萄球菌感染野生型與敲除NOD2基因的小鼠時(shí)肺部的菌落數(shù)（pulmonary CFUs）并沒有明顯的區(qū)別，但是嗜肺軍團(tuán)菌感染敲除NOD1、NOD2或RIP2基因的小鼠時(shí)肺細(xì)菌負(fù)荷（pulmonary bacterial burden）提高[11]。在人的胚腎細(xì)胞HEK293中研究發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌（S.pneumoniae） 誘導(dǎo)NF-κB活性的提高是依賴于NOD2的，利用HEK293和人的呼吸系統(tǒng)上皮細(xì)胞系A(chǔ)549研究發(fā)現(xiàn)在能夠分泌成孔毒素溶血素的肺炎鏈球菌感染的情況下來自革蘭氏陰性病原體流感嗜血桿菌（H.influenzae） 的肽聚糖能夠激活NF-κB誘導(dǎo)1L-8的分泌，該過程表現(xiàn)出依賴NOD1的特征，流感嗜血桿菌與肺炎鏈球菌的成孔毒素溶血素在激活NOD1的相關(guān)性也反映出呼吸道多種微生物共存的特點(diǎn)[12]。分支桿菌感染敲除NOD2基因小鼠的巨噬細(xì)胞時(shí)腫瘤壞死因子α的分泌量明顯減少，在人類的一個(gè)NOD2基因移碼突變的純合子個(gè)體的單核細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核菌（M.tuberculosis）誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α的分泌量也明顯減少[13]。

2 NLRC4和NAIPs

在配體的誘導(dǎo)下，一些NLRs蛋白能夠形成異源聚合物結(jié)構(gòu)成為炎性體（inflammasomes），作為平臺(tái)通過CARD結(jié)構(gòu)域招募胞質(zhì)中的前體胱冬蛋白-1（Procaspase-1），通過溶蛋白性裂解激活caspase-1，caspase-1進(jìn)而把前體1L-1β和前體1L-18激活為1L-1β和1L-18。在特定情況下caspase-1還能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。炎性體中的CARD結(jié)構(gòu)域可能來自于NLRs蛋白或銜接蛋白，例如：細(xì)胞凋亡相關(guān)顆粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal CARD，ASC）。NLRC4和NAIP （NLR family apoptosis inducing protein）都屬于NLRs蛋白家族，與其他NLRs家族的成員類似NAIPs的蛋白結(jié)構(gòu)C末端為L(zhǎng)RR，中部為NOD，N末端為BIR。配體激活后NLRC4的NOD區(qū)域與NAIP聚合形成共同形成NLRC4炎性體，激活前體caspase-1，BIR結(jié)構(gòu)域參與PAMPs誘導(dǎo)的NLRC4寡聚化，由于NLRC4含有CARD結(jié)構(gòu)域ASC銜接蛋白是否參與NLRC4炎性體的形成還有待進(jìn)一步證明[14]。體外實(shí)驗(yàn)主要集中在對(duì)巨噬細(xì)胞中NLRC4炎性體介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌情況的分析，盡管NLRC4在上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究證明[15]。在小鼠中NAIPs的同源基因有四個(gè)NAIP1、NAIP2、NAIP5與NAIP6，在人類中只研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)hNAIP蛋白[16]。小鼠中NAIPs的同源基因識(shí)別不同的配體，NAIP5和NAIP6的LRR域識(shí)別鞭毛蛋白，NAIP2的LRR域識(shí)別PrgJ（typeⅢ secretion system[T3SS]needle protein），NAIP1的LRR域也識(shí)別T3SS針蛋白[17-19]。hNAIP與NAIP5識(shí)別嗜肺軍團(tuán)菌鞭毛蛋白，在巨噬細(xì)胞中通過NLRC4炎性體抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，在人類缺失NLRC4的表皮細(xì)胞系中hNAIP能夠抑制嗜肺軍團(tuán)菌的復(fù)制說明除了NAIP/NLRC4復(fù)合體NAIPs還有其他作用途徑[20]。銅綠假單胞菌（P.aeruginosa） 通過T3SS激活NLRP4/IPAF把毒力因子分泌到宿主的胞質(zhì)中，銅綠假單胞菌能夠表達(dá)胞外酶U（ExoU）磷酸酶，能夠抑制NLRP4/caapase-1介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，盡管臨床上少于1/3的銅綠假單胞菌表達(dá)ExoU，但仍能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病可能與ExoU毒力因子的作用機(jī)制是不依賴于NLRP4有關(guān)[21]。肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae）能不經(jīng)過鞭毛蛋白或T3SS激活NLRP4，其激活途徑還不清楚[22]。另外，在人類的巨噬細(xì)胞中堪薩斯分枝桿菌（M.kansasii）能夠通過NLRP3誘導(dǎo)1L-1β，抑制堪薩斯分枝桿菌的生長(zhǎng)[23]。細(xì)胞凋亡是依賴caspase-1的程序性細(xì)胞死亡過程，位于炎性體的下游，激活的caspase-1在細(xì)胞膜上形成氣孔，允許陽離子（Ca2+）穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，經(jīng)過一系列細(xì)胞生理過程最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。炎性體也不是總導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，肺炎克雷伯菌在小鼠的巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞中經(jīng)NLRC4激活1L-1β，但并沒有觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[25]。相反，嗜肺軍團(tuán)菌與銅綠假單胞菌可經(jīng)過NLRC4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。細(xì)胞的自噬作用或許參與了細(xì)胞凋亡過程，當(dāng)嗜肺軍團(tuán)菌感染小鼠的巨噬細(xì)胞時(shí)NLRC4與NAIP5參與自噬體的形成過程，細(xì)胞的自噬作用抑制細(xì)胞凋亡過程[27]。

圖1 細(xì)胞中NLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

胞質(zhì)中的NLRs與病原微生物表面的病原體相關(guān)分子模式 （pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）識(shí)別和相互作用后激活下游促炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，引起機(jī)體的防御或炎癥反應(yīng)。

3 NLRP3

NLRP3不僅在人和小鼠的巨噬細(xì)胞中表達(dá)，而且在人和小鼠呼吸道上皮細(xì)胞中NLRP3炎性體參與細(xì)菌引起的炎癥反應(yīng)過程[28-31]。NLRP3是NLRs家族中NLRP亞家族的成員，可被PAMPs和DAMPs激活，前者包括病毒與細(xì)菌（如流感病毒、金黃色葡萄球菌、結(jié)合分枝桿菌、衣原體）等，后者包括組織損傷、應(yīng)激、感染等情況下宿主細(xì)胞釋放的活性氧、尿酸鹽結(jié)晶、ATP以及外源性物質(zhì)二氧化硅、石棉等，然后在相關(guān)蛋白與酶的作用下形成NLRP3炎性體。NLRP3炎性體是由NLRP3蛋白、ASC、caspase-1組成。NLRP3炎癥復(fù)合體可以活化Pro-caspase-1，激活的caspase-1可以通過剪切的方式活化炎癥因子Pro-1L-1β及Pro-1L-18，從而使大量成熟的1L-1β及1L-18得以釋放，參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，NLRP3通過N末端的PYD結(jié)構(gòu)域和ASC的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，招募激活前體胱冬蛋白-1（Procaspase-1），ASC是參與凋亡的含有195個(gè)氨基酸殘基的接頭蛋白，N末端是PYD結(jié)構(gòu)域，可與NLRP3的N末端PYD結(jié)構(gòu)域作用調(diào)節(jié)CARD結(jié)構(gòu)域的寡聚狀態(tài)，ASC的C末端為CARD結(jié)構(gòu)域受上游信號(hào)分子調(diào)節(jié)寡聚化[32-34]。NLRP3炎性體的激活需要兩種信號(hào)分子，首先通過TLR激活NF-κB誘導(dǎo)NLRP3的表達(dá)，當(dāng)胞內(nèi)NLRP3的表達(dá)量達(dá)到一定閾值后在NLRP3配體的作用下形成炎性體，盡管其他的炎性體可能不受TLR的影響，但是TLR信號(hào)確實(shí)能夠增加胞內(nèi)Pro-1L-1β的表達(dá)量及成熟的1L-1β的釋放[35]。通常情況下NLRP3炎性體在識(shí)別病原體或機(jī)體自身危險(xiǎn)信號(hào)前處于自身抑制狀態(tài)，對(duì)其激活的機(jī)制尚未完全清楚，目前發(fā)現(xiàn)NLRP3的激活方式有三種：（1）細(xì)胞外的三磷酸腺苷激活細(xì)胞膜受體P2X7，激活的P2X7介導(dǎo)K+的外流與Ca2+內(nèi)流，同時(shí)Pannexin-1在細(xì)胞膜上形成小孔，配體內(nèi)流激活NLRP3，細(xì)胞在許多情況下都能表現(xiàn)出K+的外流，例如：膜通透性的改變、膜上小孔的形成，溶酶體與線粒體的損傷等；（2） 活性氧（ROS） 參與NLRP3炎性體的激活，研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體的激活劑可以誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，ROS的抑制劑可以抑制炎性體的激活[36]；（3）當(dāng)硅、石英、膽固醇結(jié)晶等晶體類物質(zhì)被細(xì)胞吞噬后形成內(nèi)吞泡，與溶酶體結(jié)合后破壞溶酶體，從溶酶體中釋放一些酶類物質(zhì)如組織蛋白酶B，可以直接或間接激活NLRP3炎性體[37]。

NLRP3炎性體能夠識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，釋放炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)，是目前研究相對(duì)較多的一個(gè)炎性體，參與多種肺部疾病的發(fā)生。金黃色葡萄球菌能夠引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織的壞死，甲氧西林金黃色葡萄球菌的毒力因子α溶血素通過活化NLRP3炎性體產(chǎn)生大量細(xì)胞因子1L-1β與1L-18，導(dǎo)致細(xì)胞程序化死亡，NLRP3缺失的小鼠感染金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的肺炎程度較輕。肺炎鏈球菌溶血素與其他細(xì)菌的成孔毒素，例如：鏈球菌溶血素 O（Streptococcus pyogenes）、α溶血素（S.aureus），也能誘導(dǎo)NLRP3炎性體的形成。在人類和小鼠的巨噬細(xì)胞中能夠分泌成孔毒素溶血素的肺炎鏈球菌 （S.pneumoniae） 能夠經(jīng)過NLRP3誘導(dǎo)1L-1β，而且激活NLRP3可對(duì)抗對(duì)肺炎鏈球菌感染小鼠[38]。研究還發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體不僅在防御早期的肺炎鏈球菌肺炎免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，還參與A型流感病毒性肺炎、結(jié)核分枝桿菌的炎癥反應(yīng)[39-41]。臨床上由類鼻疽伯克菌引起的類鼻疽病導(dǎo)致的肺部感染很常見，在類鼻疽病小鼠模型中巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞中1L-1β與1L-18的表達(dá)明顯增高，NLRP3缺失的小鼠對(duì)類鼻疽伯克菌的敏感性增強(qiáng)[42]。在衣原體肺炎小鼠模型中肺部通過NLRP3炎性體產(chǎn)生大量1L-1β，caspase-1缺失的小鼠1L-1β的產(chǎn)生延遲，肺部清除細(xì)菌的能力降低，死亡率增高[43]。慢性阻塞性肺炎主要是由于煙草煙霧與細(xì)菌感染引起的多因子疾病，長(zhǎng)期慢性刺激導(dǎo)致氣道重塑、黏液纖毛清除能力降低或肺實(shí)質(zhì)受損。CS誘導(dǎo)尿酸與焦磷酸鈣的形成，通過NLRP3炎性體激活caspase-1[44]。目前越來越多的研究表明NLRP3炎性體在COPD與哮喘的慢性炎癥中發(fā)揮作用。研究表明caspase-1或NLRP3缺失的COPD小鼠肺組織勻漿、BALF和誘導(dǎo)痰中1L-1β大量減少，1L-1β是1L-1受體的重要配體，敲除1L-1受體小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞明顯減少[45]。在小鼠哮喘模型的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中血清淀粉樣蛋白A通過激活NLRP3炎性體分泌1L-1β[46]。

細(xì)菌性肺疾病發(fā)病率逐年提高，肺部對(duì)細(xì)菌的固有免疫反應(yīng)是一把雙刃劍，受損的反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致危及生命的感染，而一個(gè)不受控制的反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致危及生命的炎癥性疾病。盡管NLRs在該過程起到重要的作用，但還有許多未知問題。NLRs家族的新成員、配體及下游的調(diào)控因子還在不斷被發(fā)現(xiàn)，TLRs與NLRs受體，以及與細(xì)胞的自我吞噬之間相互聯(lián)系的分子調(diào)控的機(jī)制也是一個(gè)新的研究方向。針對(duì)NLRs炎癥復(fù)合體的靶向治療可能成為肺感染性疾病防治的方法之一，在動(dòng)物模型中利用caspase-1、1L-1β和1L-1受體的拮抗劑、尿酸抑制劑、尿酸酶、別嘌呤醇治療TLRs介導(dǎo)的炎癥已取得了很大的成功[47]。盡管已經(jīng)證明NLRs參與了肺感染性疾病及慢性炎癥的發(fā)生過程，然而，其參與的分子機(jī)制尚未完全明白，進(jìn)一步研究其激活或調(diào)控機(jī)制為肺感染性疾病的治療提供新的思路與手段。

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