氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431蛋白激酶D1及其磷酸化位點(diǎn)的影響

顧靜 王付亮 王來群 劉保國 周萌 苗國英 李小靜

453400河南長(zhǎng)垣，河南宏力醫(yī)院皮膚科（顧靜、王來群）；河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院（王付亮）；河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科（劉保國、周萌、苗國英、李小靜）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）發(fā)病原因主要與過量紫外線照射所致DNA損傷、修復(fù)功能紊亂以及宿主免疫耐受狀態(tài)有關(guān)。目前，鱗癌的治療多采用常規(guī)手術(shù)、激光、冷凍和放療等方法直接去除或破壞腫瘤組織。氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）已用于治療皮膚癌和癌前病變，其具體作用機(jī)制有待深入研究。蛋白激酶D1（PKD1）是鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶D家族中最重要的一員，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)行為，對(duì)維持表皮平衡發(fā)揮著重要的作用［1?4］。PKD1基因（PRKD1）位于人類染色體14qll位置，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，其中包括黑素瘤、基底細(xì)胞癌等［5?8］。我們前期［9］實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，其在皮膚鱗癌組織中明顯高表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨著鱗癌組織惡性程度的增高而增強(qiáng)。本研究觀察ALA?PDT對(duì)人皮膚鱗癌細(xì)胞株A431 PKD1及其磷酸化位點(diǎn)的影響，探討PKD1是否在光動(dòng)力療法中發(fā)揮作用。

材料和方法

一、主要試劑及儀器

鹽酸ALA外用散（ALA粉劑）（上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥有限公司）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、胰酶、無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司）；細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（CCK?8）（日本同仁化學(xué)研究所）；AnnexinV?FITC/PI雙染法凋亡試劑盒（美國BD公司）；RIPA強(qiáng)效裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；濃縮型兔抗人PKD1多克隆抗體、酪氨酸位點(diǎn)Tyr463磷酸化PKD1（pTyr463）多克隆抗體、絲氨酸位點(diǎn)S916磷酸化PKD1（pSer916）單克隆抗體，滴度分別為1∶500、1∶1 000、1∶5 000（英國abcam公司）；二抗（山羊抗兔，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。其余試劑和耗材均由河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。LED?IB光動(dòng)力治療儀（武漢亞格光電技術(shù)有限公司）、核酸蛋白檢測(cè)儀（英國Therno scientific公司）、ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：A431細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，接種到含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2恒溫孵育箱中，每24～48小時(shí)換液，2～3 d當(dāng)細(xì)胞增殖到80%～90%融合成片的單層細(xì)胞時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按1∶2傳代接種。

2.預(yù)實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A431細(xì)胞，將ALA粉劑溶入DMEM培養(yǎng)基中，配置成終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的ALA溶液，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后制成2×105/ml的細(xì)胞懸液，每孔100 μl接種到96孔板，置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為4組，每組9個(gè)復(fù)孔，棄原培養(yǎng)基，分別加入以上4種濃度的DMEM?ALA溶液，避光孵育3 h后接受波長(zhǎng)632 nm、總能量分別為1、2、3 J/cm2的光動(dòng)力治療（每組ALA劑量所對(duì)應(yīng)的各能量組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔），24 h后行細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。篩選最佳的光照劑量和ALA濃度組合用于實(shí)驗(yàn)。

3.實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分ALA?PDT組、ALA組、單純光照組（PDT組）及對(duì)照組（不進(jìn)行ALA或PDT處理）。ALA組和ALA?PDT組培養(yǎng)基加入ALA溶液，PDT組與對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，各組均避光孵育4 h后，更換培養(yǎng)基后備用。

4.CCK?8法檢測(cè)細(xì)胞活力：按照上述方法將各組細(xì)胞予以相應(yīng)處理后分別繼續(xù)孵育12、24、36、48 h，每一時(shí)間點(diǎn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，以僅有培養(yǎng)基作為對(duì)照，周圍一圈加等體積無菌PBS。向每孔加入10 μl CCK?8溶液，繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（A值）。得到的A值去掉最大值和最小值，其余取均值計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率（IR）。IR=［1-（處理后A值-培養(yǎng)基A值）/（處理前A值-培養(yǎng)基A值）］×100%。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A431細(xì)胞，以5×105/ml接種于6孔板，2 ml/孔，待細(xì)胞貼壁后，用不含血清DMEM同步化24 h，按照方法3分組給予最佳的光照劑量和ALA濃度組合干預(yù)后培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照凋亡試劑盒說明書操作，檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

6.反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定ALA?PDT后不同時(shí)間點(diǎn)PRKD1 mRNA的表達(dá)：收集ALA?PDT作用于細(xì)胞后0、6、12、24、36、48 h的A431細(xì)胞，依照Total RNA 提取試劑說明書提取RNA。核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA純度后按照試劑盒要求的條件合成cDNA，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用ABI 7500型熒光定量PCR儀擴(kuò)增，引物及內(nèi)參照由寶生物工程（大連）有限公司合成，PRKD1：正向引物 5′?ATGCAGCTTTCATGTATC CACCA?3′，反向引物 5′?GCATTCCAGCTCTCGCAA ATCTA?3′，產(chǎn)物177 bp；內(nèi)參照GAPDH：正向引物5′?AGAAGGCTGGGGCTCATTTG?3′，反向引物 5′?AGGGGCCATCCACAGTCTTC?3′，產(chǎn)物 258 bp。計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量（△△Ct），△Ct=Ct（PRKD1）-Ct（GAPDH），△△Ct=2?△Ct，每組重復(fù)3次取均值。

7.Western印跡法測(cè)定各組細(xì)胞中PKD1及其磷酸化位點(diǎn)的蛋白表達(dá)：收集每組細(xì)胞各1×107個(gè)，用RIPA裂解緩沖液提取蛋白，以BCA法測(cè)定并計(jì)算樣品蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，清洗后置于5%脫脂奶粉液中室溫封閉。加一抗于4℃過夜后加二抗，避光條件下?lián)u床振蕩1 h，清洗后應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)采圖，ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析與兩因素方差分析，用SNK?q檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度ALA與照射能量下ALA?PDT對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

不同濃度ALA與照射能量下，ALA?PDT對(duì)A431細(xì)胞增殖抑制率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.49，P＜ 0.05），ALA濃度為1.5 mmol/L、光照劑量為2 J/cm2時(shí)的增殖抑制率高于其他濃度與光照劑量組（均P＜0.05）。見表1。

二、CCK?8法檢測(cè)4組細(xì)胞不同孵育時(shí)間對(duì)增殖的影響

經(jīng)處理的4組A431細(xì)胞孵育不同時(shí)間后的增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.56，P＜0.05）。孵育24 h時(shí)，ALA?PDT組細(xì)胞增殖抑制率高于其他3組（均P＜0.05）。ALA?PDT組細(xì)胞孵育24 h的增殖抑制率高于12 h（P＜ 0.05），與36、48 h增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖1。

三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)相應(yīng)干預(yù)后24 h，對(duì)照組、ALA組、PDT組、ALA?PDT組細(xì)胞凋亡率分別為（4.67±0.88）%、（7.02 ± 1.52）%、（8.37 ± 0.59）%、（41.92 ± 3.23）%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.32，P＜0.05），ALA?PDT組高于其他3組（均P＜0.05）。見圖2。

四、ALA?PDT后不同孵育時(shí)間點(diǎn)對(duì)PRKD1 mRNA表達(dá)的影響

ALA?PDT作用于A431細(xì)胞后0、6、12、24、36、48 h，細(xì)胞PRKD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.24，P＜0.05），孵育后24 h低于孵育后0、6、12 h（均P＜ 0.05），與36、48 h 的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖3。

五、ALA光動(dòng)力療法對(duì)A431細(xì)胞中PKD1及其不同位點(diǎn)磷酸化的影響

對(duì)照組、ALA組、PDT組、ALA?PDT組A431細(xì)胞中pSer916表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），PKD1和pTyr463表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），ALA組、PDT組PKD1、pTyr463的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而ALA?PDT組細(xì)胞中PKD1、pTyr463的表達(dá)低于對(duì)照組、ALA組、PDT組（均P＜0.05）。見表2。

表1 A431細(xì)胞經(jīng)不同濃度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光動(dòng)力療法處理后24 h增殖抑制率（%，±s）

表1 A431細(xì)胞經(jīng)不同濃度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光動(dòng)力療法處理后24 h增殖抑制率（%，±s）

注：n=6。a與相同ALA濃度不同照射能量組比較，P＜0.05；b與相同照射能量不同ALA濃度組比較，P＜0.05

ALA濃度（mmol/L）0.5 1.0 1.5 2.0照射劑量1 J/cm2 9.25±0.24 15.23±0.24 18.30±0.53 22.05±1.01 2 J/cm2 11.08±0.65 24.68±0.52 46.26±1.25ab 29.27±0.57 3 J/cm2 17.42±0.52 25.00±0.91 29.49±0.23 25.25±1.28

圖1 氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）作用于A431細(xì)胞的時(shí)間-增殖抑制率曲線圖

討 論

圖3 氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）作用A431細(xì)胞后蛋白激酶D1 mRNA的表達(dá) 與24 h組相比，a：P＜0.05；b：P＞0.05

表2 氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）作用于A431細(xì)胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位點(diǎn)Y463（pTyr463）與磷酸化絲氨酸位點(diǎn)S916（pSer916）相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2 氨基酮戊酸光動(dòng)力療法（ALA?PDT）作用于A431細(xì)胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位點(diǎn)Y463（pTyr463）與磷酸化絲氨酸位點(diǎn)S916（pSer916）相對(duì)表達(dá)量（±s）

注：n=3。a與對(duì)照組、ALA組、PDT組比較，均P ＜0.05

組別對(duì)照組ALA組PDT組ALA?PDT組F值P值蛋白激酶D1 2.15±0.33 1.96±0.41 2.05±0.16 0.88±0.14a 10.04＜0.05 pTyr463 1.02±0.25 0.85±0.36 1.01±0.07 0.46±0.06a 8.27＜0.05 pSer916 0.64±0.03 0.60±0.04 0.62±0.03 0.40±0.02 1.53＞0.05

圖2 各組A431細(xì)胞接受相應(yīng)干預(yù)24 h后流式AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果 2A：對(duì)照組；2B：僅氨基酮戊酸組；2C：僅光動(dòng)力照射組；2D：氨基酮戊酸光動(dòng)力照射組

皮膚鱗癌作為角質(zhì)形成細(xì)胞來源的皮膚腫瘤，其發(fā)生與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的失衡密切相關(guān)，有研究證實(shí)，PKD1在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及分化過程中發(fā)揮重要作用［10］。PKD1促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的機(jī)制尚不清楚。長(zhǎng)期紫外線輻射損傷是皮膚鱗癌形成的主要因素之一，相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中波紫外線通過Tyr463位點(diǎn)激活細(xì)胞中的PKD1，有助于已經(jīng)遭受紫外線引起的角質(zhì)形成細(xì)胞DNA突變繼續(xù)擴(kuò)散，甚至形成皮膚腫瘤［11］。

ALA?PDT是由光能激發(fā)光敏劑后引起光化學(xué)反應(yīng)，選擇性殺傷腫瘤組織而不破壞正常的組織結(jié)構(gòu)，對(duì)周邊正常組織損傷小，不產(chǎn)生瘢痕，可重復(fù)多次治療［12?13］。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PKD1及pTyr463在A431細(xì)胞中高表達(dá)，經(jīng)ALA光動(dòng)力作用后水平明顯降低，甚至原本表達(dá)較低的pSer916變的更低，而單純ALA組和單純光照組與對(duì)照組相比無明顯差異。推測(cè)PKD1在A431細(xì)胞中可能是通過Tyr463位點(diǎn)活化而促進(jìn)癌變的發(fā)展，同時(shí)也提示PKD1可能參與ALA?PDT誘導(dǎo)鱗癌細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。

ALA?PDT療法近年越來越多地運(yùn)用于皮膚腫瘤的治療，UVB在損傷角質(zhì)形成細(xì)胞且激活PKD1的同時(shí)誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生［11］，而ALA?PDT療法正是利用選擇性聚集于腫瘤組織中的光敏劑，在一定波長(zhǎng)的光激發(fā)下，發(fā)生一系列光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生大量單態(tài)氧和活性氧自由基，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。Zhang等［14］的相關(guān)研究揭示，PKD1參與線粒體去極化，是調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生閾值的關(guān)鍵因素。我們?cè)谂R床治療中發(fā)現(xiàn)，ALA?PDT治療24 h內(nèi)部分皮損局部出現(xiàn)紅斑、水腫及輕度糜爛等現(xiàn)象，并伴有忍受范圍內(nèi)的灼熱感、癢感或者輕微疼痛，一般經(jīng)冷敷或其他相應(yīng)處理后約2 d可自行消退，這可能和ALA引起的光敏作用有關(guān)［15］。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)ALA?PDT作用24 h時(shí)A431細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率達(dá)到最高，同時(shí)PRKD1 mRNA的表達(dá)較治療前明顯降低，36、48 h與其相比沒有明顯差別（均P＜0.05）。這種時(shí)相上的同步，提示PKD1可能參與ALA?PDT療法中的光化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程，具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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