結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體PCR定量檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用研究

迪麗達(dá)爾?庫德熱提 高劍 黃巧玲 郭南 李慧 艾克拜爾?熱合曼（通訊作者）

（1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室 新疆 烏魯木齊 830011）（2喀什地區(qū)結(jié)核病防治所 新疆 喀什 844000）（3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室 新疆 烏魯木齊 830011）

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌所引發(fā)的對人體造成慢性傳染性的疾病。WHO 2017年的報道指出[1]，印度結(jié)核病患病人數(shù)居世界第一位，其次是印度尼西亞和中國。新疆地區(qū)結(jié)核病流調(diào)結(jié)果顯示[2]，活動性肺結(jié)核患病率為1526.12人/10萬。結(jié)核病給社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展及社會穩(wěn)定帶來很大的負(fù)面影響，所以能夠?qū)Y(jié)核疾病早發(fā)現(xiàn)早診斷是預(yù)防結(jié)核病的關(guān)鍵之所在。目前，較為常見的診斷方法主要有培養(yǎng)法、抗酸染色法和熒光定量PCR法，其中熒光定量PCR技術(shù)以其簡單快速，成本低廉，高靈敏度和高特異度等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的某些缺陷。本研究通過采用熒光定量PCR技術(shù)分別對標(biāo)準(zhǔn)菌株、結(jié)核分枝桿菌PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)品和結(jié)核病擬診病例痰標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測，與傳統(tǒng)方法即痰涂片法，菌培養(yǎng)法進(jìn)行比較，評價了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體核酸擴(kuò)增熒光檢測法快速檢測痰標(biāo)本的靈敏度和特異性。

1.資料和方法

1.1 一般資料

選取2015年4月—2016年8月在喀什地區(qū)結(jié)核病醫(yī)院進(jìn)行治療的200例患者痰液標(biāo)本200 份，其中肺結(jié)核患者119例作為試驗組，女性57例，男性62例，平均年齡35.8±7.9歲，平均病程2.4±1.4個月；非結(jié)核病患者81例作為對照組，女性37例，男性44例，平均年齡36.1±8.6歲，平均病程2.4±1.7個月。其中肺結(jié)核疾病患者都與肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]相符。對患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行采集備用。

1.2 儀器和試劑

BIO-RAD IQ5熒光定量PCR儀（廣州東盛生物科技有限公司）；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒(新疆阿爾森生物科技有限公司)；結(jié)核分枝桿菌分離和鑒定培養(yǎng)基（上海哈靈生物科技有限公司），分枝桿菌抗酸染色液（上海哈靈生物科技有限公司），DNA提取試劑盒QIAamp DNA mini（德國凱杰公司）。

1.3 方法

1.3.1痰涂片抗酸染色鏡檢 依照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》進(jìn)行常規(guī)方法操作，制作痰標(biāo)本，染色后鏡檢分級計數(shù)。

1.3.2分枝桿菌培養(yǎng)和鑒定 痰標(biāo)本在4%NaOH的消化后，在酸性羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌的培養(yǎng)，利用PNB生長試驗對分枝桿菌的菌型進(jìn)行鑒定，具體過程為從生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)基上選取單一菌落制成菌液（10mg/mL），然后接種到PNB培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，觀察盛裝狀況。分枝桿菌的培養(yǎng)和鑒定具體操作步驟依照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》進(jìn)行。

1.3.3痰液中DNA提取和熒光定量PCR技術(shù) 取50mLPBS（pH=6.8）加入到4%NaOH進(jìn)行消化的痰標(biāo)本中，15分鐘后，離心（3000r/min）20分鐘，棄去上清液，加入50μLTE進(jìn)行滅活20分鐘，然后沸水浴保持10分鐘，離心（12000r/min）5分鐘，取2μL上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照PCR試劑盒操作說明書，將提取的樣本DNA加入PCR反應(yīng)管,按規(guī)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。利用陽性梯度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值(循環(huán)閾值)所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線制定出樣品的DNA拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

（1）陽性率比較

在本實驗中，對200份標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中熒光定量PCR法72（61%）顯陽性，培養(yǎng)法38（32%）顯陽性，涂片法28（24%）顯陽性，熒光定量PCR技術(shù)的檢出率最高,細(xì)菌培養(yǎng)法次之且檢測時間較長,涂片法檢出率最低，（見表）檢出率差異有顯著性（P＜0.05）。

（2）靈敏度與準(zhǔn)確度

熒光定量PCR法的靈敏度為96.77%，準(zhǔn)確度為96.01%。

表 肺部疾病患者的檢測結(jié)果（3種檢測方法陽性率統(tǒng)計）

3.討論

結(jié)核病的發(fā)病原因是感染了結(jié)核桿菌，一旦發(fā)病，會對各個器官造成嚴(yán)重影響，其中以肺結(jié)核最為多見。在我國，結(jié)核病的發(fā)病率較高，且徹底治愈較為困難[4]。對結(jié)核病進(jìn)行早診斷早治療是能夠進(jìn)一步控制結(jié)核病傳染的基礎(chǔ)，能夠有效的改善患者的預(yù)后情況。雖然細(xì)菌培養(yǎng)法和痰涂片法是目前臨床上常用的方法，但是細(xì)菌培養(yǎng)法耗時長，且靈敏度較低，又容易出現(xiàn)漏檢[5]。痰涂片法陽性率較低，尤其是對腦脊液標(biāo)本，平均為10%(0～87%)[6]。熒光定量PCR法是當(dāng)標(biāo)本加入一條與靶基因序列互補(bǔ)的熒光雙標(biāo)記寡核苷酸探針后能夠在出現(xiàn)特異性PCR擴(kuò)增時有特異性的熒光出現(xiàn)。通過檢測熒光值的變化對擴(kuò)增產(chǎn)物的量進(jìn)行確定[7-9]。

在本實驗中，對200份標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中，熒光定量法陽性檢出率最高，差異顯著（P＜0.05）。在靈敏度檢測中，熒光定量PCR法顯陽性高于培養(yǎng)法和涂片法，差異顯著（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明熒光定量PCR法與傳統(tǒng)方法比較，檢出率較高，靈敏度好，特異性高。出現(xiàn)假陽性率的概率低，能夠在結(jié)核病早期作出快速診斷，對于臨床高度疑似病例而痰涂片和菌培養(yǎng)法都是陰性的患者以及對結(jié)核病患者治療后的療效監(jiān)測都很適用，進(jìn)一步為臨床效果和預(yù)后提供參考價值。綜上所述，熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌的應(yīng)用效果較好，建議將熒光定量PCR法作為常規(guī)檢測，以提高結(jié)核分枝桿菌檢測的準(zhǔn)確率。

[1]http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/

[2]楊津明，杰恩斯·斯馬胡勒，邰新蓉，李月華，趙珍，新疆維吾爾自治區(qū)2010-2011年結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果分析。中國防癆雜志2013，Vol.35，No.12，960-964

[3]楊洪毅,石潔,劉國棟,等.熒光定量PCR技術(shù)在痰結(jié)核菌檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(8):1483-1484.

[4]王霖,王輝,李才信,等.熒光定量PCR技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用研究[J].中國衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理,2016,7(11):169-171.

[5]杜彥懿，王平，張文莉，等.涂片鏡檢法與培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果比較[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，31(24)：83-84.Du YY，Wang P，Zhang WL，et a1.Results of smear microscopv and culture methods to detect Mycobacterium tuberculosis comparison.[J]Nei Mollgol Journalof Traditional Chinese Medicine，2011，31(24)：83-84.

[6]胡忠義.結(jié)核性腦膜炎實驗室診斷進(jìn)展[J].中華Il缶床醫(yī)藥，2002，22(3)：83—85.

[7]張賀偉.熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌臨床應(yīng)用分析[J].醫(yī)藥.2016(4):00262-00262.

[8]金建東.熒光定量PCR檢測痰結(jié)核桿菌DNA及其臨床應(yīng)用[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，31(22)：3565—3566.

[9]王雅寧.熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌臨床應(yīng)用分析[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012, 19(9):1404-1406.