膀胱癌中miR-203的表達(dá)及其對(duì)吉西他濱化療敏感性的影響

林 垚，沈 洲，牛三強(qiáng)，許 言，劉 治，宣 強(qiáng)

目的探討microRNA-203(miR-203)在膀胱癌中的表達(dá)以及其對(duì)吉西他濱化療敏感性的影響。方法應(yīng)用Vita-Blue法檢測膀胱癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱的敏感性差異并測定半數(shù)抑制濃度(IC50)值。應(yīng)用探針法實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Taqman-qRT-PCR) 檢測27例膀胱癌組織和癌旁組織以及膀胱癌細(xì)胞系5637、Um-Uc-3、J82、SCaBER、T24、Biu87中miR-203的表達(dá)水平。同時(shí)構(gòu)建帶有四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的miR-203超表達(dá)載體(pINDUCER21-EGFP-miR-203)，在吉西他濱化療耐受的Um-Uc-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203，并用多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)，未誘導(dǎo)表達(dá)的為陰性對(duì)照，在化療敏感的T24細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-203 Antagomir和Antagomir control，同樣使用Taqman-qRT-PCR和Vita-Blue方法檢測膀胱癌細(xì)胞系中miR-203表達(dá)水平的變化及對(duì)吉西他濱的敏感性。結(jié)果在膀胱癌組織中miR-203的表達(dá)顯著低于癌旁組織，在膀胱癌細(xì)胞系T24中miR-203的表達(dá)水平最高，Um-Uc-3細(xì)胞系中表達(dá)水平最低(P<0.01)。膀胱癌細(xì)胞系T24和Um-Uc-3細(xì)胞中對(duì)吉西他濱的IC50值分別為(0.46±0.08)ng/ml和(5.94±0.53)ng/ml(P<0.01)；pINDUCER21-EGFP-miR-203(D+)可以明顯增加Um-Uc-3細(xì)胞的化療敏感性,而miR-203 Antagomir可以顯著抑制T24細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化療敏感性。結(jié)論miR-203與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，其高表達(dá)水平將提高膀胱癌對(duì)吉西他濱的化療敏感性。

膀胱癌；miR-203；吉西他濱；化療敏感性

由于經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，膀胱癌的發(fā)病率在我國呈顯著上升趨勢。膀胱癌常規(guī)手術(shù)后化學(xué)療法是治療局部疾病有效方法。雖然大約50%的晚期患者對(duì)初始化療有反應(yīng)[1]，但由于復(fù)發(fā)率較高導(dǎo)致在大多數(shù)患者中再次發(fā)生，這些患者對(duì)新一輪化療藥物將產(chǎn)生一定的藥物耐受[2]。因此，對(duì)癌癥化療耐藥的深入理解是必要的，以改善個(gè)性化化療。吉西他濱聯(lián)合順鉑是臨床上膀胱癌化療的一線用藥，但是吉西他濱化療耐受將極大影響到治療效果，如在胰腺癌[3]、肺癌[4]和乳腺癌[5]均出現(xiàn)吉西他濱耐受現(xiàn)象。微小RNA(microRNA，miRNA)是天然存在的一類非編碼RNA分子，其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)并且涉及到細(xì)胞生化過程，例如細(xì)胞增殖，癌癥的發(fā)生、凋亡和化療耐受。目前有一部分miRNA與吉西他濱化療耐受相關(guān)，如miR-21[5]，miR-155[3]。然而miR-203在膀胱癌中對(duì)吉西他濱化療敏感性的研究尚不清楚，該研究主要通過探針法實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Taqman-qRT-PCR)、Vita-Blue法探討miR-203在膀胱癌中的表達(dá)及其對(duì)吉西他濱化療敏感性。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2015年6月～2017年3月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿外科進(jìn)行手術(shù)的27例膀胱癌患者，其臨床及病理資料均完善，取膀胱癌組織及對(duì)應(yīng)距腫瘤邊緣>3 cm的新鮮癌旁組織，于液氮罐中暫時(shí)保存，最終儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，全部患者均為初診，在外科手術(shù)治療之前均未進(jìn)行任何方式的治療，術(shù)后病理結(jié)果均為膀胱癌，其中男21例，女6例，年齡48～82(62.3±2.1)歲，根據(jù)2004年世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，高級(jí)別10例，低級(jí)別17例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年第七版TNM分期法標(biāo)準(zhǔn)，非肌層浸潤性膀胱癌16例，肌層浸潤性膀胱癌9例。

1.2細(xì)胞系6株人膀胱癌細(xì)胞株分別為5637、Um-Uc-3、J82、SCaBER、T24、Biu87細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.3主要試劑及儀器RPMI-1640、MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Winsent公司)；10×PCR buffer、dNTP、Mg2+、Hs-Taq酶(上海睿安生物科技有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑(南京諾維贊生物科技公司)；TRIzol(北京天根生物有限公司)；Klenow酶、T4連接酶、MluⅠ酶(日本TaKaRa公司)；Taq-man實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物和探針(上海閃晶生物科技公司)；miR-203 Antagomir(miR-203拮抗劑)和Antagomir control(miR-203拮抗劑對(duì)照組)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；pINDUCER21-EGFP質(zhì)粒(大連醫(yī)科大學(xué)汪洋教授饋贈(zèng))；多西環(huán)素(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；Tanon 1600凝膠成像儀(上海天能公司)。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞系5637、T24、Biu87、J82和SCaBER用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，Um-Uc-3用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以上細(xì)胞系均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2pINDUCER21-EGFP-miR-203質(zhì)粒的構(gòu)建 pINDUCER21-EGFP為帶有四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，在MluI單酶切后，去磷，補(bǔ)平黏性末端，作為miR-203的載體，從膀胱癌癌旁組織提取的基因組DNA作為模板，用miR-203的正反向引物擴(kuò)增出目的片段(從UCSC數(shù)據(jù)庫獲取miR-203基因成熟序列的上下游區(qū)各100 bp，位于chr14:104583642-104583951，primer5.0設(shè)計(jì)上下游引物，miR-203 正向引物：5′-GGGGATCTGGGCGCAGGGGCCGGTC-3′ 反向引物：5′-CGTGGGCTCCCCTGGATTGGTC-3′，產(chǎn)物長度286 bp，退火溫度57 ℃)，引物用T4多聚核苷酸激酶加磷，PCR結(jié)束后，Klenow酶補(bǔ)平末端，后進(jìn)行T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，次日統(tǒng)計(jì)平板克隆數(shù)目，挑取重組平板克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證(引物分別位于載體上和miR-203成熟序列，正向引物：5′- GTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGT-3′，反向引物：5′-CGGGTCTAGTGGTCCTAAACATTTC-3′，產(chǎn)物長度450 bp，退火溫度56 ℃)。

1.4.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前1天以3×105個(gè)/孔的密度接種于6 孔板。使用雙無培養(yǎng)基，用不含血清的配套培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000,輕輕混合,37 ℃溫育5 min。用無血清的配套培養(yǎng)基稀釋miR-203 Antagomir和pINDUCER21-EGFP-miR-203及對(duì)照組Antagomir control。稀釋好的上述溶液混合，37 ℃溫育20 min。同時(shí)6孔板用配套培養(yǎng)基沖洗1次，再加入相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基，使用移液器緩慢加入Lipofectamine 2000的混合溶液。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育6 h，去除轉(zhuǎn)染試劑和培養(yǎng)基,加入含有血清的配套培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育48 h后檢測。

1.4.4Vita-Blue法檢測細(xì)胞活性并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(the half-inhibitory concentration，IC50)值 將處于對(duì)數(shù)期的膀胱癌細(xì)胞系5637、T24、Biu87、J82、SCaBER和Um-Uc-3經(jīng)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，按104個(gè)/孔接種在96孔板，設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，每種細(xì)胞分6組，24 h貼壁后棄去培養(yǎng)基，用0、2、4、6、8、10 ng/ml的吉西他濱分別處理各細(xì)胞系，根據(jù)化療耐受情況，調(diào)整各組的吉西他濱濃度，孵育72 h后，每孔加入20 μl的Vita-Blue試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～4 h(注意顏色的變化)。用熒光計(jì)數(shù)器(激發(fā)光570 nm)記錄熒光讀數(shù)，用沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞活力(%)=(A藥物+-A空白對(duì)照) / (A藥物--A空白對(duì)照) ×100%，通過Msvbvm50軟件計(jì)算IC50值。

1.4.5Taqman-qRT-PCR檢測miR-203的表達(dá)水平 使用TRIzol-A+ Reagent說明書提取組織和細(xì)胞中總RNA，以3.5 μl總RNA作為模板，使用帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，PCR混合體系5.8 μl，引物和探針(miR-203和U6)混合體系4.8 μl，ddH2O 8.4 μl。miRNA-203 RT-PCR引物序列如下，miR-203逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-GCGCGTGAGCAGGCTGGAGAAATTAACCA CGCGCCTAGTG-3′；F：5′-CGGGTGAAATGTTTAGG-3′；R：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；Probe 5′FAW-AACCACGCGCCTAGTG-3′MGB；U6 RT-PCR引物序列如下，U6逆轉(zhuǎn)錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCA GGGTCCGAGGTATTCGCACTGATACGACAAAAATAT G-3′；F：5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′；R：5′-CTTCAC GAATTTGCGTG-3′；Probe5′HEX-CCTTGCGCAGGGG CCATGC-3′MGB；反應(yīng)條件：95 ℃、5 min；50個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃、20 s，60 ℃、20 s)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6作為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，膀胱癌組織和癌旁組織miR-203表達(dá)水平的比較使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，多組間差異比較采用多樣本均數(shù)比較的方差分析,其他組間均數(shù)比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1pINDUCER21-EGFP-miR-203質(zhì)粒的構(gòu)建驗(yàn)證結(jié)果重組pINDUCER21-EGFP-miR-203質(zhì)粒經(jīng)PCR驗(yàn)證正確，結(jié)果見圖1。

2.2miR-203在膀胱癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平在27例膀胱癌組織和癌旁組織中應(yīng)用Taqman-qRT-PCR方法檢測miR-203的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在膀胱癌組織中miR-203表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.541，P<0.01)，見圖2。

圖1 重組pINDUCER21-EGFP-miR-203質(zhì)粒驗(yàn)證電泳圖

A：pINDUCER21-miR-203重組質(zhì)粒驗(yàn)證陽性；B、C：pINDUCER21-miR-203重組質(zhì)粒驗(yàn)證陰性；D：水對(duì)照；M：DL2000 Marker

圖2 miR-203在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平

2.3Vita-Blue法檢測膀胱癌細(xì)胞系對(duì)化療藥物吉西他濱的IC50值在膀胱癌細(xì)胞系中Um-Uc-3細(xì)胞對(duì)吉西他濱的IC50值最高，其次是Biu87、SCaBER、J82、5637、T24。與Um-Uc-3細(xì)胞IC50值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=158.92，P<0.01),見圖3。

2.4miR-203在膀胱癌細(xì)胞系Um-Uc-3和T24中的表達(dá)水平在膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞中miR-203(5.941±0.529)與Um-Uc-3細(xì)胞中miR-203(0.456±0.078)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.80，P<0.05)。

2.5pINDUCER21-EGFP-miR-203和miR-203Antagomir在Um-Uc-3和T24細(xì)胞系中對(duì)吉西他濱的化療敏感性影響根據(jù)在Um-Uc-3和T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染結(jié)果，轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203(D+，加入多西環(huán)素)的Um-Uc-3細(xì)胞(0.489±0.061)與轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203(D-，未加多西環(huán)素)對(duì)照組(0.312±0.049)相比，其表達(dá)水平顯著升高(t=6.80,P<0.01)，轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察見圖4；轉(zhuǎn)染miR-203 Antagomir的T24細(xì)胞(1.148±0.119)與對(duì)照組(1.417±0.155)相比，其表達(dá)水平降低(t=4.13,P<0.01)；另外，Um-Uc-3和T24細(xì)胞在不同藥物濃度的作用下轉(zhuǎn)染結(jié)果用Vita-Blue法分析，轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203(D+)的Um-Uc-3細(xì)胞在較高藥物濃度下相對(duì)細(xì)胞生存率降低(t2=0.20、P=0.84，t4=1.10、P=0.30，t6=5.26、P<0.01，t8=5.07、P<0.01，t10=5.58、P<0.01)，轉(zhuǎn)染miR-203 Antagomir的T24細(xì)胞在較高藥物濃度下相對(duì)的細(xì)胞生存率升高(t0.2=0.34、P=0.74，t0.4=5.15、P<0.01，t0.6=9.03、P<0.01，t0.8=2.36、P=0.04，t1.0=5.72、P<0.01)，見圖5。

圖3 吉西他濱在不同膀胱癌細(xì)胞系中的IC50值 與Um-Uc-3的IC50值比較：**P<0.01

圖4 熒光顯微鏡下觀察Um-Uc-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染結(jié)果 ×100

A:Um-Uc-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 pINDUCER21-EGFP-miR-203(D-);B: Um-Uc-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203(D+)

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中多數(shù)患者初發(fā)為非肌層浸潤性膀胱癌。在臨床上經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)是治療非肌層浸潤性膀胱癌的快捷有效手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，可達(dá)50%～70%，大多數(shù)患者于術(shù)后2 年內(nèi)復(fù)發(fā)，但是術(shù)后輔以化療藥物的膀胱灌注可在一定程度上延緩復(fù)發(fā)[6]?；诩魉麨I的化療已廣泛用于肌層浸潤性或轉(zhuǎn)移性膀胱癌，從而使高達(dá)70%的患者有反應(yīng)。不幸的是，由于癌細(xì)胞的化學(xué)耐藥性，在超過50%的情況下，化療藥物反應(yīng)不能維持，導(dǎo)致5年存活率低于15%[7]。目前對(duì)于膀胱癌有效治療的主要障礙是對(duì)化療藥物的耐受性[8]，但是在許多類型的癌癥中機(jī)制不清楚。

圖5 不同藥物濃度作用下轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率

D-：未加入多西環(huán)素；D+：加入多西環(huán)素；與pINDUCER21-EGFP-miR-203(D-)比較；*P<0.05，**P<0.01；與Antagomir control比較：##P<0.01

miRNA是長度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子。大多數(shù)miRNA通過阻斷mRNA抑制mRNA翻譯，僅一些mRNA降解或去腺苷化，然而還有小部分的miRNA介導(dǎo)mRNA靶向上調(diào)。由于miRNA的種子序列的6～8個(gè)堿基與mRNA的所需結(jié)合的低嚴(yán)格性，從而每個(gè)miRNA可能潛在地與數(shù)百個(gè)mRNA靶標(biāo)相互作用。異常表達(dá)的miRNA已經(jīng)顯示在許多類型的癌癥中起到抑癌或促癌的作用。而且miRNA的表達(dá)譜可以提供關(guān)于化療敏感性的信息，其 miRNA表達(dá)的變化可能是化療反應(yīng)的一種標(biāo)志物。近年來，miRNA在吉西他濱化療耐受方面的研究越來越多，如miR-21通過EMT過程調(diào)節(jié)參與了乳腺癌中吉西他濱耐藥[5]，miR-155在胰腺導(dǎo)管癌中高表達(dá)從而促進(jìn)對(duì)吉西他濱的化療耐受[3]。

本研究通過Taqman-qRT-PCR檢測miR-203在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在膀胱癌組織中是低表達(dá)，癌旁組織高表達(dá)，與Bo et al[9]研究一致，進(jìn)一步說明miR-203在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到抑癌基因的作用。Vita-Blue法檢測6株膀胱癌細(xì)胞系5637、Um-Uc-3、J82、SCaBER、T24、Biu87對(duì)吉西他濱藥物的IC50值，其對(duì)吉西他濱化療敏感性的順序依次為T24、Biu87、SCaBER、J82、5637、Um-Uc-3，最為耐受的Um-Uc-3細(xì)胞系是最為敏感細(xì)胞系T24的13.04倍。隨后繼續(xù)通過Taqman-qRT-PCR檢測miR-203在膀胱癌細(xì)胞系T24和Um-Uc-3中的表達(dá)，結(jié)果顯示對(duì)吉西他濱化療最為敏感的T24細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于最為耐受的Um-Uc-3細(xì)胞。從而推測吉西他濱的化療敏感性與miR-203的表達(dá)相關(guān)。

該研究通過構(gòu)建帶有四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的miR-203的超表達(dá)載體pINDUCER21-EGFP-miR-203，在相對(duì)耐受的Um-Uc-3的細(xì)胞中上調(diào)miR-203的表達(dá)，而miR-203 Antagomir在T24細(xì)胞中抑制miR-203的表達(dá)，從而觀察對(duì)吉西他濱化療耐受的影響，Taqman-qRT-PCR和Vita-Blue實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示在Um-Uc-3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pINDUCER21-EGFP-miR-203(D+)組與對(duì)照組相比，表達(dá)水平升高，其細(xì)胞生存率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在T24細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-203 Antagomir組與對(duì)照組相比，表達(dá)水平降低，細(xì)胞生存率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明在膀胱癌細(xì)胞系中miR-203的表達(dá)水平對(duì)吉西他濱化療敏感和耐受的細(xì)胞生存率密切相關(guān)。本研究尚需要進(jìn)一步在分子層面進(jìn)行靶向基因和信號(hào)通路的研究，更深入的了解具體的化療耐受機(jī)制。

綜上所述，本研究表明miR-203在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，其高表達(dá)水平將提高膀胱癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱的化療敏感性。 此外，miR-203具有作為吉西他濱治療方案中的預(yù)測性生物標(biāo)志物的潛力。

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