高耐鎘硫酸鹽還原菌群的特性研究

王玉雙， 李一路， 郭照輝， 單世平， 付祖姣， 靳 磊， 魏小武， 黃 軍

(湖南省微生物研究院，湖南長沙 410009)

通信作者：黃 軍，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)微生物研究。E-mail：ssp312@hotmail.com。

硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacterium，SRB)是一類厭氧或兼性厭氧菌，廣泛存在于土壤、海底淤泥、油田及地下管道等缺氧或局部缺氧環(huán)境中。自1985年Jerinck首次發(fā)現(xiàn)SRB以來，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已發(fā)現(xiàn)且合法有效的SRB有40個屬、137個種[1]。SRB區(qū)別于其他菌種的一個重要生理特征是能夠利用硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等硫氧化物及硫元素作為電子受體將其還原為硫化氫[2]。重金屬離子可與硫化氫反應生成穩(wěn)定性極強的硫化物沉淀，人們利用這一特征已將SRB廣泛應用于重金屬污染廢水、廢氣的治理[3-5]。

在眾多重金屬污染源中，強毒性的鎘污染對生態(tài)環(huán)境和人類的毒害早已引起了世界各國高度重視。目前，利用硫酸鹽還原菌對鎘污染進行治理已成為研究熱點[6]。此研究的前提在于高耐鎘硫酸鹽還原菌的篩選及如何提高篩選菌對硫酸鹽的還原效率。由于大部分硫酸鹽還原菌只能存活于厭氧或缺氧環(huán)境中，其分離純化對試驗設備要求高，在實際應用中多菌種協(xié)同作用效果更好[7]。

從實際應用角度出發(fā)，富集馴化硫酸鹽還原菌群能節(jié)約時間及成本。前人報道了1種復合SRB-SRBⅢ，主要由脫硫弧菌、脫硫腸狀菌等組成，因其有很強的還原重金屬離子的能力，在冶金、電鍍等行業(yè)的重金屬廢水處理中有較為廣泛的應用。馬忠友等分離了1組硫酸鹽混合菌群，在FeSO4初始濃度為2 g/L時恒溫靜置培養(yǎng)30 h后，硫酸鹽還原率達95%以上[7]。潘嘉川等從海底底泥中富集馴化了1組高耐鹽的海洋硫酸鹽還原菌群，并對影響該菌群脫硫率的影響因子進行了考察[8]。本研究從湖南省株洲市鎘污染礦區(qū)淤泥中富集馴化出1組硫酸鹽還原菌群SRB10，考察該菌群對鎘、鹽及氧的耐受性，并在不同溫度、pH值、硫酸根離子濃度條件下，研究其生長特性及硫酸鹽還原率，最后通過正交試驗確定該菌群的最佳脫硫工藝條件，旨在為鎘污染土壤的微生物修復及含硫酸鹽、重金屬廢水的生物治理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SRB10菌群的富集馴化：該菌群由筆者實驗室從株洲市鎘污染礦區(qū)淤泥中分離所得，并經(jīng)多次富集馴化后保存。

1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，NH4Cl 1.0 g，Na2SO40.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，乳酸鈉 5 mL，酵母提取物1.0 g。將上述試劑溶解在1 L水中，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，121 ℃高壓滅菌20 min。冷卻后再加入經(jīng)過濾除菌的1 mL 1.2%硫酸亞鐵銨，1 mL 0.4%濃度抗壞血酸。

無硫基礎培養(yǎng)基：K2HPO40.65 g，NH4Cl 1.0 g，CaCl2·2H2O 0.04 g，MgCI2·6H2O 0.06 g，乳酸鈉3.5 mL，酵母提取物1.0 g。將上述試劑溶解在1 L水中，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 SRB10菌群的特性研究

1.3.1 SRB10菌群對不同硫源的利用情況 在無硫培養(yǎng)基中分別加入硫酸鈉、硫代硫酸鈉、亞硫酸鈉、單質(zhì)硫及硫酸鈣為硫源，以5%的接種量將菌液分別接種于上述培養(yǎng)基，30 ℃靜置恒溫培養(yǎng)2～3 d后觀察培養(yǎng)基顏色變化及PbAc試紙變色情況。

1.3.2 SRB10菌群對鎘及鹽的耐受能力 以5%的接種量將菌液分別接種于一系列鎘濃度梯度及鹽濃度梯度的液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)2～3 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化及PbAc試紙變色情況。

1.3.3 SRB10對氧氣的耐受能力 以5%的接種量將菌液接種于液體培養(yǎng)基中，按照好氧和厭氧條件對其進行恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察培養(yǎng)基顏色變化及PbAc試紙變色情況。

1.3.4 溫度、pH值及SO42-濃度對SRB10菌群生長及硫酸鹽還原率的影響 (1)以5%接種量將SRB10接種于液體培養(yǎng)液中，分別置于20、25、30、35、40、50、60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、20、40、60 h后取樣。以未接種的培養(yǎng)液作空白對照，測定各培養(yǎng)液的D600 nm、D420 nm值。(2)以5%接種量將SRB10接種于pH值分別為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的培養(yǎng)液中，恒溫培養(yǎng)48 h。以未接種的培養(yǎng)液作空白對照，測定各培養(yǎng)液的D600 nm、D420 nm值。(3)以5%接種量將SRB10接種于SO42-濃度梯度為500、1 500、2 500、3 500、4 500、5 500、6 500 mg/L的培養(yǎng)液中，恒溫培養(yǎng)48 h。以未接種的培養(yǎng)液作空白對照，測定各培養(yǎng)液的D600 nm、D420 nm值。

1.3.5 正交試驗設計 為了提高SRB10菌群硫酸鹽還原率，利用正交試驗法對各因素進行了優(yōu)化。選取溫度30、35、40 ℃，硫酸根濃度1 000、1 500、2 000 mg/L，pH值7.5、8.0、9.0，培養(yǎng)時間40、48、56 h，采用L9(34)表進行4因素3水平正交試驗。每組設置3組平行試驗。

1.3.6 硫酸鹽還原率的測定 測定SRB10菌群對硫酸鹽的還原率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRB10菌群對不同硫源的利用

本試驗中SRB10菌群對不同硫源的利用情況如表1所示。SRB10菌群可以很好地利用硫酸鈉、硫代硫酸鈉、單質(zhì)硫、硫酸鈣作為硫源，其中利用硫代硫酸鈉的效果最好，不能利用亞硫酸鈉作為硫源。

表1 SRB10菌群對不同硫源的利用

注：“++”表示生長較好；“+”表示可以生長；“-”表示不能生長。下表同。

2.2 SRB10菌群對鎘及鹽的耐受性

在不同鎘濃度梯度的培養(yǎng)基中接種SRB10菌群后恒溫培養(yǎng)48 h，結(jié)果顯示：培養(yǎng)基中鎘濃度為0～175 mg/L時，菌群能正常生長，培養(yǎng)基顏色變黑，底層有大量黑色沉淀產(chǎn)生，PbAc試紙顯色明顯。當鎘濃度上升至200 mg/L時，培養(yǎng)基顏色無變化，PbAc試紙不顯色，說明菌群在此濃度下基本不生長。此結(jié)果表明，SRB10菌群對鎘的耐受性可達 175 mg/L[9-10]，屬于高耐鎘菌群。

對SRB10菌群進行耐鹽性考察結(jié)果顯示：當培養(yǎng)基中鹽濃度從0升至40 g/L時，SRB10菌群能夠較好生長并還原硫酸鹽，培養(yǎng)基顏色較黑。當鹽濃度升至50 g/L時，該菌群仍能生長，具有一定的還原能力，培養(yǎng)基顏色變黑，但變化程度不顯著。超過此濃度范圍培養(yǎng)基顏色無變化，PbAc試紙不顯色，即菌群無法生長。說明該菌群的耐鹽范圍在0～50 g/L。海洋微生物的耐鹽機制高于傳統(tǒng)的微生物[8]，本試驗富集的SRB10菌群亦屬于高耐鹽菌群。

2.3 SRB10菌群對氧氣的耐受性

早期研究者認為，SRB屬于嚴格厭氧菌，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，SRB應屬于兼性厭氧菌，能在一定濃度的氧環(huán)境下生存甚至占優(yōu)勢[11-12]。本試驗分離的SRB10菌群在不同氧濃度條件下生長情況如表2所示。菌群在搖瓶培養(yǎng)時培養(yǎng)基不變黑，PbAc試紙不顯色，而將該菌群分別置于加石蠟油或不加石蠟油的培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基均變黑，PbAc試紙顯色，說明SRB10菌群屬于兼性厭氧菌。

表2 SRB10菌群對氧氣的耐受性

2.4 溫度對SRB10菌群生長及硫酸鹽還原率的影響

溫度直接影響SRB的生長速度及代謝活動。溫度太低抑制了細胞內(nèi)酶的活性，SRB菌不生長或生長緩慢，溫度過高則會使得細胞中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸及其他生物活性物質(zhì)發(fā)生不可逆改變，參與生化反應的功能喪失，甚至導致SRB菌死亡[13]。目前人們分離的SRB多為中溫性菌，可生長溫度為20～45 ℃，最適宜生長溫度為28～38 ℃[14]。本試驗分離的SRB10菌群在不同溫度下的生長情況如圖1所示。該菌群的生長溫度范圍較寬，在20～40 ℃下均能生長，其中在30～40 ℃下生長速度較快，最適宜生長溫度為35 ℃，這與前人的研究結(jié)果基本一致。SRB10菌群在不同溫度、不同培養(yǎng)時間下對硫酸鹽還原情況如圖1所示。當培養(yǎng)溫度為20 ℃時，SRB10菌群對硫酸鹽的還原能力一般，硫酸鹽還原率僅為25.28%；隨著培養(yǎng)溫度的上升，SRB10菌群的還原能力逐漸增強，當培養(yǎng)溫度為30～40 ℃時，隨著培養(yǎng)時間的延長，SRB10菌群對硫酸鹽的還原能力高達97%以上；隨著溫度的繼續(xù)上升，硫酸鹽還原率下降。此結(jié)果與SRB10菌群的生長情況基本一致。

2.5 pH值對SRB10菌群生長及硫酸鹽還原率的影響

構(gòu)象、性質(zhì)、生物學活性與穩(wěn)定性，引起細胞膜電荷的改變[15]。適宜的pH值有利于SRB的生長繁殖。SRB10菌群在不同pH值的培養(yǎng)基中生長情況及對硫酸鹽還原情況如圖2所示。該菌群對pH值的適應范圍較廣，在pH值6.0～10.0 范圍內(nèi)均能生長代謝，其中適宜的pH值范圍為7.0～10.0，在此范圍內(nèi)，菌群對硫酸鹽的還原率可達85%以上。菌群在pH值7.5時生長最為旺盛，對硫酸鹽的還原率達 89.24%。此結(jié)果表明，該菌群更適于在偏堿性條件下生長。

2.6 硫酸根濃度對SRB10菌群生長及硫酸鹽還原率的影響

硫酸根濃度對SRB代謝活動的影響主要表現(xiàn)在，低濃度硫酸根濃度會促進SRB的生長和代謝，而高濃度的硫酸根使得SRB在還原過程中產(chǎn)生過量的中間產(chǎn)物(如亞硫酸根)或產(chǎn)物(H2S氣體)，這會抑制SRB的生長及代謝[16]。SRB10菌群在不同SO42-濃度下生長及還原硫酸鹽情況如圖3所示。隨著SO42-濃度升高，SRB10的生長情況及對硫酸鹽的還原能力均呈先上升后下降的趨勢。當硫酸根濃度為 1 500 mg/L 時，SRB10菌群的繁殖速度最快，對硫酸鹽還原能力最強，隨著SO42-濃度進一步升高，該菌群的生長及還原力急劇下降。由此結(jié)果可知，該菌群的最適硫酸根濃度為 1 500 mg/L。

2.7 正交試驗結(jié)果

為了優(yōu)化SRB10菌群還原硫酸鹽的最適條件，本研究在單因子試驗的基礎上進行了正交試驗(表3)。結(jié)果顯示：4因素的主次順序為C>A>B>D，即4因素對SRB10菌群還原能力影響的強度順序為SO42-、pH值、溫度、培養(yǎng)時間。根據(jù)均值結(jié)果，確定出SRB10菌群的最佳脫硫工藝條件為A2B2C1D1，即pH值8.0、溫度35 ℃、SO42-濃度1 000 mg/L、培養(yǎng)時間40 h。

3 結(jié)論

經(jīng)過多次富集和馴化，獲得的SRB10菌群屬于兼性厭氧菌群，能在鎘濃度為175 mg/L或鹽濃度為50 g/L的條件下正常生長。該菌群能夠利用硫酸鈉、硫代硫酸鈉、單質(zhì)硫作為硫源，其中利用硫代硫酸鈉的效果最好。該菌群為中溫耐堿性菌群，單因子試驗顯示，在35 ℃的培養(yǎng)溫度，pH值7.5和1 500 mg/L硫酸根濃度下，SRB10菌群生長最快，還原硫酸鹽的能力最強。正交試驗結(jié)果表明，影響SRB10菌群還原率的因素強度順序為SO42-、pH值、溫度及時間。最佳工藝條件為pH值8.0、溫度35℃、SO42-濃度1000mg/L、培養(yǎng)時間40 h，此條件下硫酸鹽還原效率可達98.91%。本試驗富集的SRB10菌群所需培養(yǎng)時間短，對硫酸鹽還原力強，且高耐鎘，在重金屬鎘污染修復中具有較好的應用前景。但SRB10菌

表3 SRB10菌群正交實驗結(jié)果

群對于重金屬鎘的吸附試驗、吸附機理以及其對實際重金屬鎘污染土壤的修復效果還有待進一步研究。

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