基于電導(dǎo)率快速測定豆類細(xì)胞破壁率方法的研究

黨通州，羅劍飛，林煒鐵

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與生物工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與成分具有高度的復(fù)雜性和多樣性[1]，具有一定的硬度和彈性，細(xì)胞壁的存在抑制了細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的釋放。研究表明，經(jīng)破壁后的靈芝孢子粉，其多糖、有機(jī)酸和三萜類等成分含量極為豐富，藥用價值較實體靈芝高75倍[2]。植物細(xì)胞的破壁率是指植物細(xì)胞的破碎程度，與有效成分的釋放直接相關(guān)。有關(guān)破壁率的研究報道并不多，主要集中于中醫(yī)藥的研究，檢測方法是借助顯微鏡觀察特征細(xì)胞數(shù)來衡量破壁率。浙江中醫(yī)藥大學(xué)的石森林利用顯微觀察的方法測定了六味地黃丸的破壁率，并研究了破壁率與粒徑、有效成分溶出度的相關(guān)性關(guān)系[3]。陜西中醫(yī)藥大學(xué)的宋忠興、趙鵬等人，利用該方法分別測定了丹參、黃芩、苦參和秦艽4種常用中藥微細(xì)粉體的細(xì)胞破壁率[4]。該方法需要在顯微鏡下人工目測記錄不同視野的特征細(xì)胞數(shù)目，工作量大且容易受到操作熟練程度及計數(shù)時段的影響，重復(fù)性較差。另外由于豆類的特征細(xì)胞不明顯，目前對于豆類的破壁率研究較少。

生活中，豆?jié){是一種很受歡迎的早餐飲品。豆?jié){的蛋白質(zhì)含量較高，且含有多種礦物質(zhì)元素及多種人體必需的微量元素，營養(yǎng)豐富[5]，人體的吸收率較高[6]。傳統(tǒng)豆?jié){的制作工藝比較復(fù)雜，為縮短時間，豆?jié){機(jī)，破壁料理機(jī)的出現(xiàn)，但是使用料理機(jī)制作的豆?jié){，其營養(yǎng)品質(zhì)未知。豆?jié){的營養(yǎng)品質(zhì)與破壁率成正相關(guān)，檢測破壁率可以間接衡量豆?jié){的品質(zhì)。破壁率一般檢測方法采用顯微觀察特征細(xì)胞的方法，工作量大，重復(fù)性差，另一方面，由于豆類細(xì)胞的特征細(xì)胞不明顯，不易尋找。蛋白作為豆類的主要營養(yǎng)成分，但以蛋白衡量破壁率存在試劑的消耗且耗時。

電導(dǎo)率是指溶液的導(dǎo)電能力，電導(dǎo)率越大則導(dǎo)電性能越強(qiáng)。相關(guān)研究表明，電導(dǎo)率與植物有效成分提取之間存在一定的相關(guān)性，采用電導(dǎo)率可以快速、準(zhǔn)確的指示植物有效成分的提取規(guī)律和提取終點[7,8]。豆類細(xì)胞破壁后，細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)釋放出來，在水溶液中具有一定的導(dǎo)電性，破壁率越高電導(dǎo)率就越高。本文通過研究豆子在破碎過程中，其水溶性蛋白釋放量與其電導(dǎo)率之間的關(guān)系，從而建立一種以電導(dǎo)率為指標(biāo)快速評價破壁率的方法，并利用該方法測定了四種豆子在破壁料理機(jī)豆?jié){程序下制備豆?jié){的破壁率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四種豆子（大豆、黑豆、綠豆和紅豆），購自沃爾瑪超市，參照GB/T 5497-1985測定四種豆子的水分含量[9]，分別為 7.00±1.00%、7.33±0.58%、5.67±0.57%和10.33±1.15%；參照GB 50095-2010測定四種豆子的粗蛋白含量[10]，分別為31.12±0.43%、32.91±0.34%、20.60±0.40%和18.29±0.27%。

考馬斯亮藍(lán) G-250、乙醇、磷酸等均為分析純；蒸餾水（電導(dǎo)率≤3 μs/cm），購自屈臣氏；牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品購自上海生工。

AUX-PB956破壁料理機(jī)：佛山市海迅有限公司提供；UV-2802SH型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Orion Star A215臺式電導(dǎo)率/pH測量儀：美國奧利龍公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆?jié){的制備

（1）豆?jié){的制備：精密稱取四種干豆子50 g，以1:12的比例加入600 g水，利用破壁料理機(jī)9檔分別處理 10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s、90 s、100 s、110 s和120 s制備豆?jié){；精密稱取四種干豆子50 g，以1:12的比例加入600 g水，利用破壁料理機(jī)的豆?jié){程序制備四種豆?jié){。

（2）完全破壁豆?jié){的制備：破壁料理機(jī)豆?jié){程序制備好的豆?jié){，利用料理機(jī)9檔處理2 min后；在-80 ℃冷凍20 min，然后40 ℃水浴15 min，如此操作重復(fù)3次；超聲（功率為150 W，頻率為25 kHz，間歇2 s）破壁處理20 min；使用研缽進(jìn)行研磨10 min。此方法制作的豆?jié){作為一種完全破壁的豆?jié){溶液。

1.2.2 電導(dǎo)率的測定

精密移取一定體積的豆?jié){，用恒溫的蒸餾水定容至80 mL，攪拌均勻，然后使用電導(dǎo)率/pH測量儀測定溶液電導(dǎo)率。

1.2.3 水溶性蛋白的測定

取2 g豆?jié){，用蒸餾水稀釋至一定倍數(shù)后，3000 r/min離心5 min后取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測定豆?jié){中的水溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水為空白對照，于595 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD595nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=0.003x-0.006（R2=0.9950）。

1.2.4 破壁率測定的影響因素

利用電導(dǎo)率測定待測豆?jié){和完全破壁豆?jié){水溶液的電導(dǎo)率，計算破壁率。即破壁率為待測豆?jié){水溶液的電導(dǎo)率與相同體積的完全破壁豆?jié){水溶液的電導(dǎo)率之比。

1.2.4.1 豆?jié){用量對破壁率測定的影響

分別移取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL和16 mL的豆?jié){樣品和完全破壁的豆?jié){樣品，均用蒸餾水定容80 mL后，攪拌均勻常溫下測定電導(dǎo)率，計算破壁率。

1.2.4.2 外滲時間對破壁率測定的影響

豆?jié){樣品和完全破壁豆?jié){樣品利用蒸餾水定容至80 mL 后，攪拌均勻后，分別靜置0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min后，常溫下測定電導(dǎo)率，計算破壁率。

1.2.4.3 測定溫度對破壁率測定的影響

豆?jié){和完全破壁豆?jié){利用蒸餾水定容至 80 mL后，分別在不同溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）水浴鍋中水浴10 min，然后測定電導(dǎo)率，計算破壁率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)初步整理使用 Excel 2017（Microsoft Corporation），以SPASS 22.0（IBMCo.Ltd）軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，并利用OriginPro 8.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電導(dǎo)率與水溶性蛋白的相關(guān)性

圖1 大豆（a）、黑豆（b）、綠豆（c）和紅豆（d）的水溶性蛋白、電導(dǎo)率-時間曲線圖Fig.1 Water-soluble proteins and conductivity-time curves of soybeans (a), black beans (b), mung beans (c) and red beans (d)

普通細(xì)胞在破碎的過程中，細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)釋放出來，包括營養(yǎng)成分蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等，也有一些小分子的離子物質(zhì)，如鈉、鉀離子，胞內(nèi)物質(zhì)的釋放使得在水溶液中具有一定的導(dǎo)電性。對于常見豆子，其有效成分為植物蛋白。本實驗研究了四種豆子在破壁料理機(jī)9檔0～120 s的處理過程中，豆子中水溶性蛋白釋放量和豆?jié){的電導(dǎo)率之間的關(guān)系。豆?jié){電導(dǎo)的測定移取6 mL待測豆?jié){進(jìn)行測定。結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，四種豆子在破壁料理機(jī)處理過程中，其水溶性蛋白釋放量和電導(dǎo)率呈現(xiàn)出相同的變化趨勢。在0～80 s，水溶性蛋白釋放量和電導(dǎo)率均呈上升趨勢；80 s后，基本維持不變。利用SPASS 22.0軟件的Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行雙尾檢驗，120 s內(nèi)四種不同豆子的水溶性蛋白釋放量和電導(dǎo)率的相關(guān)性較高（p<0.01），大豆、黑豆、綠豆和紅豆的相關(guān)性系數(shù)分別為0.9796、0.9885、0.8994和0.9869。研究結(jié)果表明，四種豆子的水溶性蛋白釋放量與電導(dǎo)率的相關(guān)性較高，可以利用電導(dǎo)率間接反映水溶性蛋白的釋放量。因此可以建立一種以電導(dǎo)率為指標(biāo)快速評價豆類細(xì)胞破壁率的方法。

2.2 破壁率測定的穩(wěn)定性分析

破壁率測定的方法是分別測定待測豆?jié){和完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率，考慮植物細(xì)胞電導(dǎo)率測定的影響因素。對于經(jīng)破壁料理機(jī)處理的植物細(xì)胞，影響植物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放的因素有外滲透壓、測定溫度、破碎程度和外滲時間[12]等。破碎程度即是破壁率，檢測的對象。不同的豆?jié){用量，有著不同的滲透壓。溶液的滲透壓越低，溫度越高，外滲時間越長，會促進(jìn)完整細(xì)胞胞內(nèi)小分子物質(zhì)的釋放，從而使得破壁率測定結(jié)果偏大。以大豆豆?jié){為例，主要從豆?jié){用量、外滲時間和測定溫度等三方面考慮對破壁率的影響。

2.2.1 豆?jié){用量對破壁率測定的影響

圖2 不同豆?jié){用量的電導(dǎo)率、破壁率變化Fig.2 Changes in the conductivity and the wall-broken rate of different soymilk dosage

不同的豆?jié){用量的溶液，有著不同的滲透壓。分別移取2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL、16 mL的豆?jié){樣品和完全破壁的豆?jié){樣品，均用蒸餾水定容80 mL，攪拌均勻，常溫下測定其電導(dǎo)率值，計算破壁率。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，豆?jié){和完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率隨著豆?jié){用量的增加而不斷升高，且完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率始終稍大于豆?jié){的電導(dǎo)率，而破壁率的值保持穩(wěn)定。利用SPASS 22.0軟件的Duncan對破壁率和豆?jié){用量進(jìn)行顯著性分析，豆?jié){用量對破壁率的影響不顯著（p>0.05）。

結(jié)果表明，建立的利用電導(dǎo)率測定破壁率的方法，待測豆?jié){樣品和完全破壁豆?jié){樣品的移取量相同，則其破壁率的測定結(jié)果穩(wěn)定，說明該方法具有一定的適用性。如制作豆?jié){選取的料液比不同、豆?jié){稀釋倍數(shù)不同，均不影響破壁率的測定結(jié)果。

2.2.2 外滲時間對破壁率測定的影響

圖3 不同外滲時間的電導(dǎo)率、破壁率變化Fig.3 Changes in the conductivity and the wall-broken rate of different extravasation time

在低滲透壓的溶液中，外滲時間越長，促進(jìn)了完整細(xì)胞內(nèi)部小分子物質(zhì)的釋放，使得破壁率的測定值偏大。移取6 mL的豆?jié){和完全破壁豆?jié){，蒸餾水稀釋定容至80 mL，攪拌均勻后，靜置0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min后測定電導(dǎo)率，計算破壁率。其結(jié)果見圖3。

由圖3可知，豆?jié){和完全破壁豆?jié){，以及破壁率在不同的外滲時間下（0～30 min），其變化較為穩(wěn)定。利用SPASS 22.0軟件的Duncan對破壁率、電導(dǎo)率和外滲時間進(jìn)行顯著性分析，外滲時間對豆?jié){和完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率的影響不顯著（p>0.05），外滲時間對破壁率的影響不顯著（p>0.05）。外滲時間對于兩種豆?jié){電導(dǎo)率的影響不顯著，很有可能是因為豆類細(xì)胞與普通植物細(xì)胞的不同。結(jié)果表明，建立的利用電導(dǎo)率測定破壁率的方法，在 30 min內(nèi)外滲時間對于電導(dǎo)率、破壁率的測定結(jié)果沒有影響，說明該方法在一定程度上的可行性。

2.2.3 測定溫度對破壁率測定的影響

圖4 不同測定溫度的電導(dǎo)率、破壁率變化Fig.4 Changes in the conductivity and the wall-broken rate of different temperature

溫度對于電導(dǎo)率的測定有影響，有研究表明，溫度越高電導(dǎo)率越大。溫度對于完整細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的釋放有促進(jìn)作用，溫度越高，細(xì)胞內(nèi)部的小分子物質(zhì)釋放越多，使得電導(dǎo)率增大。移取6 mL的豆?jié){和完全破壁豆?jié){，蒸餾水稀釋定容至80 mL后，在不同溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和 45 ℃）水浴鍋中水浴10 min后，測定電導(dǎo)率并計算破壁率。其結(jié)果見圖4。

由圖4可知，豆?jié){和完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率，以及破壁率都隨溫度的增大而不斷增大。而完全破壁豆?jié){的電導(dǎo)率的變化更為平緩，說明完全破壁豆?jié){的破壁率基本為 100%。而豆?jié){樣品的電導(dǎo)率隨溫度增大而變大的原因，很有可能使在高溫下，完整細(xì)胞內(nèi)部的小分子物質(zhì)釋放到溶液中，使得溶液的電導(dǎo)率增大。利用SPASS 22.0軟件的Duncan對破壁率和溫度進(jìn)行顯著性分析，溫度對破壁率的影響非常顯著（p<0.01）。溫度在20 ℃～25 ℃之間時，其破壁率測定更為穩(wěn)定。結(jié)果表明，溫度使得破壁率的測定結(jié)果偏大。建立的利用電導(dǎo)率測定破壁率的方法，在測定溫度為20 ℃～25 ℃時，測定結(jié)果穩(wěn)定。所以利用常溫蒸餾水在室溫環(huán)境中進(jìn)行實驗測定，無需對溶液進(jìn)行水浴加熱處理。

建立的利用電導(dǎo)率快速測定豆類細(xì)胞破壁率的方法，通過研究三種不同因素對于破壁率的影響，發(fā)現(xiàn)豆?jié){用量、外滲時間對于破壁率的測定沒有影響，溫度對于破壁率的測定有影響，但常溫25 ℃左右，其測定結(jié)果相對穩(wěn)定。所以建立的方法較為穩(wěn)定，測定范圍較廣，具有一定的廣泛適用性。

2.3 破壁料理機(jī)豆?jié){程序制備豆?jié){的破壁率

采用2.1建立的以電導(dǎo)率為指標(biāo)快速測定豆類細(xì)胞破壁率的方法，測定四種豆子在破壁料理機(jī)的豆?jié){程序下制備的豆?jié){的破壁率，結(jié)果見圖 5。從而可以在一定程度評估使用破壁料理機(jī)制作豆?jié){的品質(zhì)。

圖5 四種豆子在豆?jié){程序下的破壁率（n=5）Fig.5 The wall-broken rate of four common beans by soymilk program (n=5)

由圖5可以看出，四種豆子(大豆、黑豆、綠豆和紅豆)在破壁料理機(jī)的豆?jié){程序下的破壁率分別為93.24±0.34% 、 91.06±0.51% 、 88.53±0.14% 和92.54±0.64%，其破壁率較高，說明營養(yǎng)的釋放越充分。但四種豆子的破壁率有一定差異，可能是由于不同豆子的硬度、水分含量等不同造成的。結(jié)果表明，市場上破壁料理機(jī)采用干法制作豆?jié){時，其豆?jié){程序?qū)τ诔Ｒ姸诡惖钠票诼瘦^高達(dá)到90%左右，且制作過程更加簡便，符合了現(xiàn)代人的生活要求。另外，測定結(jié)果也驗證了以電導(dǎo)率測定豆類細(xì)胞破壁率的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

3.1 本試驗研究了四種豆子在料理機(jī)處理過程中，水溶性蛋白釋放量與電導(dǎo)率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)性較高（R2≥0.8995），從而建立了一種以電導(dǎo)率快速評價豆類細(xì)胞破壁率的方法。豆?jié){用量、外滲時間、常溫測定對于破壁率沒有影響，電導(dǎo)率測定豆類細(xì)胞破壁率的方法具有較高的穩(wěn)定性，誤差在 1%以內(nèi)?？梢钥焖?、簡便、準(zhǔn)確的測定豆類細(xì)胞在制漿過程中的破壁率，在一定程度上具有廣泛的適用性。

3.2 新型破壁料理機(jī)采用干法制作豆?jié){時，其更加方便快捷，對于常見豆類的破壁率較高，達(dá)到90%左右。

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