豬鏈球菌通用型和2型雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測技術(shù)的建立和應(yīng)用

吳靜波，南文金，黃健強(qiáng)，胡鴻惠，彭國良，彭 凌，董小英

(韶關(guān)學(xué)院粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，韶關(guān) 512005)

豬鏈球菌是造成生豬養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原之一，全球幾乎100%規(guī)?；i場均有豬鏈球菌存在[1]。該菌可通過呼吸道相互傳播，主要引起敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎等。同時豬鏈球菌也是一種人獸共患病病原，可通過接觸帶菌豬或豬肉產(chǎn)品感染人，引起敗血癥、腦膜炎，甚至休克樣綜合征，導(dǎo)致死亡[1]。盡管50年來人感染豬鏈球菌大多為職業(yè)接觸性的散發(fā)病例，比如養(yǎng)殖戶、獸醫(yī)、屠夫、食品加工者等職業(yè)人群[2]；但最近幾年人感染豬鏈球菌病例的數(shù)量不斷增加，并趨向于常規(guī)人群。在中國有過兩次豬鏈球菌2型的區(qū)域大流行，分別為1998年江蘇25人感染14人死亡和2005年四川215人感染38人死亡，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[2-4]。

豬鏈球菌為革蘭陽性球菌，是豬的正常寄生菌，主要定植在豬的上呼吸道中，尤其是在扁桃體和鼻腔，也可定植于生殖器和消化道內(nèi)[5-6]。根據(jù)莢膜多糖的抗原性，將豬鏈球菌分為35個血清型(1～34型及1/2型)，在所有血清型中1、2、1/2、7、9、14型為豬群中的主要致病血清型[7]，2、14型為人群中的主要致病血清型[1]。調(diào)查顯示不管是在人群還是豬群中，2型都是最為主要的致病菌，致病力和流行率都是最高的，占全球病例數(shù)的74.7%和27.9%，是疫情監(jiān)控和病原鑒定的首要檢測對象[1,3,8]。

目前細(xì)菌分離培養(yǎng)與血清學(xué)分型結(jié)合仍然是診斷豬鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)[1,9]，但此方法耗時，靈敏度低，操作要求高，不利于推廣和疫情監(jiān)測[10-11]，另外血清學(xué)方法也無法檢測出無莢膜菌株和自凝菌株[12-15]。對此研究者建立了單個或多重PCR、MLST、熒光PCR等方法對豬鏈球菌保守基因或不同血清型特異的莢膜多糖基因進(jìn)行擴(kuò)增與測序[10,13,16-24]，在基因水平上實現(xiàn)對豬鏈球菌的鑒定與分型，彌補(bǔ)了血清學(xué)分型的不足，提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。其中就包括多個豬鏈球菌通用型或2型的TaqMan熒光PCR方法，但這些方法都為單熒光PCR，無法實現(xiàn)單管內(nèi)同時檢測豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，增加了疫情監(jiān)測的工作量和成本。本研究采用TaqMan多重?zé)晒釶CR技術(shù)，以豬鏈球菌的保守基因gdh和2型特異性基因cps2J為靶基因設(shè)計兩個不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，建立了SS通用型和2型特異性的雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法，并對該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性進(jìn)行檢測；同時與常規(guī)PCR對比，檢驗其實際應(yīng)用價值，力求建立一個快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的雙重檢測方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株

所使用菌株均為本實驗室保存，包括9株經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清和血清型特異性PCR確定的豬鏈球菌1、1/2、2、3、4、7、9、14、16型；11株陰性對照菌，分別為大腸埃希菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎鏈球菌(ATCC 49619)、化膿性鏈球菌(ATCC 19615)、糞腸球菌(ATCC 29212)、乙型溶血性鏈球菌(ATCC 21059)、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、敗血波氏桿菌、豬鼻支原體(CVCC 361)、馬鏈球菌獸疫亞種(CVCC 573)。

1.2 引物探針設(shè)計

gdh基因是豬鏈球菌的保守基因[25-26]，在不同血清型中的一致性達(dá)到96%；cps2J是豬鏈球菌2型的型特異性基因[27]，在血清型內(nèi)較為保守，一致性達(dá)到99%。我們以豬鏈球菌2型參考株P(guān)1/2的基因組為參考序列(GenBank登錄號:AM946016)，根據(jù)gdh和cps2J基因的保守區(qū)域分別設(shè)計引物和探針，要求兩靶基因的引物及探針之間無非特異性反應(yīng)，序列如表1所示。使用FAM熒光素標(biāo)記gdh檢測探針，用于豬鏈球菌通用型的檢測；使用HEX熒光素標(biāo)記cps2J探針，用于豬鏈球菌2型的檢測。使用MAGA 5.1和Oligo 7進(jìn)行多重比對和引物探針設(shè)計，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.3 優(yōu)化雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件

試驗使用ABI 7500熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)進(jìn)行擴(kuò)增和分析，以Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(RR390，TaKaRa,中國)作為反應(yīng)緩沖液。首先在緩沖液推薦的反應(yīng)體系下進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，設(shè)置6個退火溫度，分別為50、52、54、56、58、60 ℃，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性及啟動Taq酶，然后95 ℃ 15 s變性，50～60 ℃退火延伸30 s并收集熒光，共40個循環(huán)。在確定退火溫度后則對引物和探針反應(yīng)濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計3×3矩陣表(如表2)分9個組，包括3個引物濃度(200、300、400 nmol·L-1)和3個探針濃度(100、150、200 nmol·L-1)。反應(yīng)使用25 μL反應(yīng)體系，包括12.5 μL Premix ExTaqbuffer(2×)，0.5 μL的引物(10 μmol·L-1)和探針(5 μmol·L-1)，1 μL的豬鏈球菌2型基因組DNA樣品，0.25 μL ROX Reference Dye(50×)，無RNA酶水補(bǔ)至25 μL。

表1 引物和探針序列

Table 1 Sequences of primes and probes

名稱Name序列(5'-3')aSequence(5'-3')a基因組中位置bGenomepositionb產(chǎn)物大小/bpAmpliconsizeGDH-FGAGCTCTTCTCTACACTTGAGCC240807—240829114GDH-R/SRcCCATGGAACACGGAAGCTG240716—240734GDH-PFAM-TTGAAGCACACCCAGAATACATCGAAGAA-TAMRA240773—240801214GDH-SFcGGAATTCCATATGTCAAATGCC240908—240919CPS2J-FGATAGATGACGGTTCTTCAGATTCAT563492—56351793CPS2J-RCCATTTGGTAACCGGAAAAGTT563563—563584CPS2J-PdHEX-TCTACCATCTTGCTCTGCGTATTCCA-TAMRA563533—563558CPS2J-SFcAGGAATTCCATATGGAAAAAGTCAGCATTATTG563385—5634061019CPS2J-SRcCCGCTCGAGTTAATCATTATTTTTTTCTTCCC564361—564383SS2-FeGATTTGTCGGGAGGGTTACTTG450SS2-ReTAAATAATATGCCACTGTAGCGTCTCSSall-FeTTCTGCAGCGTATTCTGTCAAACG695SSall-ReTGTTCCATGGACAGATAAAGATGG

a. 下劃線標(biāo)記的為限制性酶切位點；b. 引物探針?biāo)诘幕蚪M位置是參照豬鏈球菌2型P1/7株的序列，其中g(shù)dh的引物探針序列為基因組的反向序列；c. SF和SR為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的普通PCR引物，其中GDH-R/SR同時應(yīng)用于雙重?zé)晒舛縋CR和普通PCR中；d. CPS2J-P為下游探針；e. 引物序列參考文獻(xiàn)[17]

a. The underscores is the restriction site;b. Genome positions were numbered according to reference sequence AM946016.1 (Serotype 2),gdhsequence is a reverse sequence;c. SF and SR were primers of conventional PCR for standard DNA, GDH-R/SR was used to duplex Real-Time PCR and conventional PCR;d. CPS2J-P is a reverse probe;e. Reference from relative reference[17]

表2 引物及探針濃度的矩陣分組情況

Table 2 The groups of difference concentration of primer and probe

探針濃度/(nmol·L-1)Probeconcentration引物濃度/(nmol·L-1)Primerconcentration200300400100A1A2A3150B1B2B3200C1C2C3

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

為繪制雙重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們在熒光定量PCR引物兩側(cè)又設(shè)計了一對引物用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品DNA，序列為表1所示的GDH-SF、GDH-SR(與熒光定量PCR引物相同)、CPS2J-SF、CPS2J-SR，擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為214和1 019 bp。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后用凝膠回收試劑盒(cat#9762，TaKaRa，中國)回收，與pMD-18T(TaKaRa，中國)載體連接后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)(TaKaRa，中國)培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒純化pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J質(zhì)粒，經(jīng)NanoDrop ND-2000C(Thermo，美國)測得濃度后計算質(zhì)粒原始拷貝數(shù)，然后用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(TaKaRa，中國)將兩質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)10倍稀釋為4×108～4×101copies·μL-18個梯度，每個梯度3個復(fù)孔進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率。

1.5 特異性、靈敏度、重復(fù)性

用我們建立的方法對“1.1”所述的9株豬鏈球菌和11株陰性菌株的基因組DNA進(jìn)行檢測，驗證方法能否在準(zhǔn)確鑒定出豬鏈球菌的同時不對陰性對照菌產(chǎn)生非特異性反應(yīng)；并驗證豬鏈球菌2型的特異性引物和探針是否對其他血清型的豬鏈球菌不產(chǎn)生非特異反應(yīng)。

對兩個質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至40、20、10、5、2.5 copies·μL-15個梯度，每個梯度3個復(fù)孔，然后用我們最優(yōu)擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行檢測，測定最低檢出極限。

使用“1.4”稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品4×107～4×103copies·μL-15個梯度進(jìn)行重復(fù)檢測，每個梯度3個復(fù)孔，在不同時間點進(jìn)行3次檢測；計算檢測結(jié)果的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)，以測定雙重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性。

1.6 臨床樣品檢測

用基因組DNA提取試劑盒(cat#9765，TaKaRa，中國)對實驗室收集的67份呼吸道疾病和關(guān)節(jié)炎的臨床病料(包括鼻拭子、關(guān)節(jié)液、扁桃體、肺等)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提?。挥梦覀兘⒌碾p重?zé)晒舛縋CR和已公布的常規(guī)PCR方法[17]平行檢測獲得的DNA模板。兩方法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：熒光定量PCR以出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線為陽性，并根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品模板拷貝數(shù)；普通PCR以電泳檢測時出現(xiàn)目的片段為陽性。根據(jù)試驗結(jié)果，使用SPSS軟件分析兩種PCR方法的符合率和一致性(kappa系數(shù))；以普通PCR結(jié)果為參照，繪

制ROC曲線，計算雙重?zé)晒舛縋CR檢測的最佳陽性閾值。

2 結(jié) 果

2.1 雙重?zé)晒舛縋CR最優(yōu)反應(yīng)條件

在對同一個樣品的重復(fù)檢測中，6個退火溫度的Ct值、擴(kuò)增曲線斜率和線型均沒有明顯的差異，但56 ℃下的結(jié)果稍好于其他退火溫度(數(shù)據(jù)未顯示)；9個引物和探針濃度組合的雙重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增結(jié)果如圖1示，結(jié)合兩個靶基因的擴(kuò)增曲線，可以看出C組的擴(kuò)增曲線比其他兩組具有更大的斜率和更小的Ct值，而C1又稍優(yōu)于C2和C3組。所以雙重?zé)晒舛縋CR的最優(yōu)退火溫度為56 ℃，最優(yōu)引物和探針濃度為200 nmol·L-1。

字母A、B、C表示探針濃度100、150、200 nmol·L-1，數(shù)字1、2、3表示引物濃度200、300、400 nmol·L-1，NC為陰性對照In the group name, A, B, C represent 100, 150, 200 nmol·L-1 probe concentration, respectively; and number 1, 2, 3 represent 200, 300, 400 nmol·L-1 primers concentration, respectively. NC represent negative control圖1 9個引物和探針濃度優(yōu)化組合的擴(kuò)增曲線圖Fig.1 Amplification curves of duplex real-time PCR for S. suis and S. suis 2 at 9 concentration groups of primer and probe

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在最優(yōu)雙重?zé)晒舛縋CR條件下分別對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-18T-GDH和pMD-18T-CPS2J的檢測，均只單獨出現(xiàn)FAM和HEX熒光曲線，即相互之間不存在非特異擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。8個濃度梯度的Ct值與對應(yīng)的拷貝數(shù)的lg值呈現(xiàn)線性關(guān)系，且線性范圍極寬；豬鏈球菌和豬鏈球菌2型的線性公式分別為y=-3.291 1x+41.154和y=-3.342 4x+41.562(y為Ct值，x為lg原始拷貝數(shù))，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 4和0.999 3，擴(kuò)增效率分別為101.303%和99.157%。

2.3 特異性、靈敏度、重復(fù)性

雙重?zé)晒舛縋CR方法在檢測9株豬鏈球菌(1、2、1/2、3、4、7、9、14、16型)基因組DNA時FAM熒光(gdh基因)均為陽性，但只有檢測2和1/2型時HEX熒光(cps2J基因)才為陽性，而在對11株陰性對照菌的檢測中雙熒光都為陰性(結(jié)果未顯示)；表明這個方法可特異性鑒別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型。

測定雙重?zé)晒舛縋CR方法檢測極限的結(jié)果如圖3所示，在最優(yōu)反應(yīng)條件下對5 copies·μL-1以上模板量的擴(kuò)增均能出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，即檢測極限值為5拷貝數(shù)。但是在低于10 copies·μL-1時試驗的穩(wěn)定性會下降(結(jié)果未顯示)。

圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴(kuò)增曲線圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Duplex RT-PCR amplification plots and standard curves of single plasmid standard DNA for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

40、20、10、5、2.5表示質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)(copies·μL-1)40, 20, 10, 5, 2.5 is the copy number of plasmid standard DNA (copies·μL-1)圖3 雙重?zé)晒舛縋CR對低濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線圖Fig.3 The detection limits of duplex RT-PCR for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

我們將3次不同時間點對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)檢測結(jié)果繪制成誤差限圖(圖4)，顯示5個質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差都在0.06～0.24，3次檢測組內(nèi)變異系數(shù)在0.24%～1.19%間，組間的變異系數(shù)在0.39%～0.97%，穩(wěn)定性極高。

2.4 臨床樣品檢測

對67份臨床樣品進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR和常規(guī)PCR檢測，結(jié)果如表3所示，雙重?zé)晒舛縋CR總共檢出53例(79.1%)豬鏈球菌通用型陽性樣品和24例(35.8%)豬鏈球菌2型陽性樣品；并且豬鏈球菌2型陽性樣品的通用型檢測也都為陽性，占豬鏈球菌陽性樣品的45.3%。對兩PCR方法結(jié)果進(jìn)行對比，顯示定量結(jié)果中模板量大于等于100拷貝數(shù)的樣品普通PCR結(jié)果都為陽性，模板量為0拷貝數(shù)的樣品普通PCR都為陰性，兩個范圍內(nèi)兩方法的結(jié)果符合率為100%。而定量結(jié)果為1～100拷貝數(shù)的樣品中，兩方法通用型和2型的符合率分別為54.5%和50%，其中5例通用型(樣品和拷貝數(shù)分別為鼻拭子7、14、15號：53、18、73，關(guān)節(jié)液1號：10，肺組織5號：66)和7例2型(樣品和拷貝數(shù)分別為鼻拭子3、6、7、8、15號：7、24、13、13、77，關(guān)節(jié)液1號：9，肺組織5號：63)樣品普通PCR為陰性，分別占熒光定量PCR通用型和2型陽性樣品的9.4%和29.2%，另外6例通用型和7例2型樣品普通PCR為陽性，其中最低拷貝數(shù)為通用型的35和2型的19。綜合統(tǒng)計分析顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法與通用型和2型普通PCR方法的符合率分別為92.5%和89.6%，kappa值分別為0.800和0.757，具有較高的一致性。以常規(guī)PCR結(jié)果為參考繪制ROC曲線(圖5)，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法通用型和2型的曲線下面積分別為0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，檢測Ct值最佳的陽性閾值分別為35和38；在這個閾值下，雙重?zé)晒舛縋CR對豬鏈球菌通用型檢測敏感度和特異度分別為89.6%和94.7%，對豬鏈球菌2型的敏感度和特異度分別為100%和94%(箭頭所指)。

右上角表格為各濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品3次重復(fù)檢測的批內(nèi)和批間變異系數(shù)Intra-and inter-assay CV of three repeated detection for different concentration plasmid was shown in the table of the top right corner圖4 雙重?zé)晒舛縋CR對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測所得Ct值的誤差限圖Fig.4 The error bar of repeatability assay for S. suis and S. suis serotype 2, respectively

表3 雙重?zé)晒舛縋CR與常規(guī)PCR對67份臨床樣品的檢測結(jié)果

Table 3 Results of duplex real-time PCR and conventional PCR for clinical samples

熒光定量PCRRT-PCR普通PCRConventionalPCR豬鏈球菌S.suis豬鏈球菌2型S.suistype2樣品類型Sampletype模板量(拷貝數(shù)/反應(yīng))Thequantityoftemplate(copies/reaction)+-+-鼻拭子Nasalswab≥100100001～100231500009關(guān)節(jié)液Articularfluid≥10010001～100111100203扁桃體Tonsil≥10050301～100002000000肺組織Lungtissue≥100260701～10031310012031總計Total≥1004201001～10065770014043

以熒光定量PCR檢測Ct值為檢驗變量，常規(guī)PCR檢測結(jié)果為狀態(tài)變量繪制ROC曲線。AUV表示曲線下面積，大于9時說明檢測方法具有很高的診斷價值，P<0.001說明診斷成立。最佳閾值是采用曲線上Youden指數(shù)最大點(Youden指數(shù)=敏感度+特異度-1)，圖上箭頭所指點The Ct value of duplex Real-Time PCR was test variable, Ct value of conventional PCR was state variable, ROC was drawn according to them. AUV mean area under curve.Detection prompted high diagnostic value when AUV was above 9, P<0.001 indicated diagnosis was established.The best positive threshold was Youden index (specificity+sensitivity-1) maximum points on curve, as the arrow in Figure 5圖5 以普通PCR檢測結(jié)果為參照繪制雙重?zé)晒舛縋CR檢測臨床樣品結(jié)果的ROC曲線Fig.5 The receiver operating characteristic curve of duplex real-time PCR detection results for clinical samples which reference to conventional PCR

3 討 論

豬鏈球菌是豬上呼吸道系統(tǒng)中的正常寄生菌，其致病性的劃分比較模糊，部分菌株感染不引起臨床癥狀，或者輕微的發(fā)熱或敗血癥；但另外一些毒株可侵入腦、心、肺等主要器官，引發(fā)大量的炎癥反應(yīng)甚至休克性死亡[28]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，1～9和14型對豬具有致病性[3]，而2、4、5、14、16、21、24型可感染人類引起臨床癥狀[1]；其中豬鏈球菌2型是毒力最強(qiáng)，并且分離頻率最高的致病株，占全球報道的豬和人臨床病例數(shù)的27.9%和74.7%[1, 3, 8]，在北美、南美、歐洲、亞洲、澳大利亞等地區(qū)都是流行率最高的血清型[1,11-12, 29-32]。在我們的臨床樣品調(diào)查中也顯示豬鏈球菌2型占豬鏈球菌陽性樣品的45.3%，比例較高。所以在豬鏈球菌的疫情監(jiān)測中，豬鏈球菌2型應(yīng)設(shè)為重點監(jiān)測對象。

豬鏈球菌病的初步診斷一般是根據(jù)臨床癥狀、接觸史和可視病理變化，確診需要通過分離鑒定出病原菌。細(xì)菌分離培養(yǎng)與血清型分型是目前全球?qū)嶒炇移毡槭褂玫脑\斷方法，其可靠性已得到研究者的認(rèn)可；但像大部分細(xì)菌一樣，豬鏈球菌的分離培養(yǎng)同樣存在靈敏度低、實驗時間長、操作要求高等缺點，所以越來越多的學(xué)者開始關(guān)注豬鏈球菌的基因分型鑒定。包括針對型特異性的莢膜多糖基因序列設(shè)計分型PCR，這部分研究大多集中在主要致病菌上，但最近有學(xué)者針對33個血清型(不包括32和34型)的cps基因設(shè)計了多個多重PCR[16,18]，建立全套的基因分型方法；當(dāng)然現(xiàn)在使用最多的還是針對豬鏈球菌多個保守基因的MLST方法[24]，此方法主要檢測cpn60、dpr、recA、aroA、thrA、gki、mutS等7個保守基因，根據(jù)這7個基因的基因型進(jìn)行編碼確定豬鏈球菌的血清型(ST)，研究者還收集這些數(shù)據(jù)建立了MLST數(shù)據(jù)庫，以方便豬鏈球菌的全球流行和分布情況的調(diào)查。

不過這兩個基因分型方法都比較費時費錢，而且交叉污染的風(fēng)險大，只能針對少量樣品；而我們建立的雙熒光定量PCR方法可以在1.5 h內(nèi)完成對大量樣品的處理和檢測，全程閉管操作，并在監(jiān)測豬鏈球菌通用型的同時可以完成對重點監(jiān)測對象豬鏈球菌2型的篩選，與其他單熒光檢測方法相比更省錢省時；而且檢測結(jié)果與常規(guī)PCR方法的符合率達(dá)到92.5%和89.6%，kappa值達(dá)到0.800和0.757，模板在普通PCR靈敏度范圍內(nèi)的樣品兩方法檢測結(jié)果符合率甚至達(dá)到100%，具有極高的一致性。當(dāng)然，也和其他PCR方法一樣，我們的方法無法區(qū)分2型和1/2嵌合型，因為這兩種血清型的CPS基因非常相似，目前只能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行區(qū)分[33-34]。

在這次研究中，我們首先確定了雙重?zé)晒舛縋CR的最優(yōu)反應(yīng)條件，并構(gòu)建了兩個靶基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA；隨后在最優(yōu)條件下對標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行檢測并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示兩個靶基因的檢測結(jié)果和原始模板量都具有極高的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.999，擴(kuò)增效率可達(dá)100%左右；并在多次的重復(fù)檢測中保持著高度的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分別低于0.24和1.19%；以細(xì)菌基因組DNA代替質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板的檢測結(jié)果同樣可保持在這個水平(數(shù)據(jù)未顯示)。

雖然我們無法收集齊35個豬鏈球菌血清型，但我們對主要的致病性血清型特別是2型進(jìn)行了檢測，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法可特異性識別豬鏈球菌和豬鏈球菌2型，兩靶基因之間無交叉反應(yīng)，并對其他鏈球菌或呼吸系統(tǒng)細(xì)菌無非特異性反應(yīng)。在保持高特異性的同時，本方法的檢測極限可達(dá)到5 拷貝數(shù)，遠(yuǎn)低于常規(guī)PCR方法，這也使得在對臨床樣品的檢測中，雙重?zé)晒舛縋CR具有更高的檢出率。不過為了保證臨床應(yīng)用的特異性，我們以普通PCR方法為參照繪制ROC曲線，顯示雙重?zé)晒舛縋CR方法的曲線下面積達(dá)到0.966(P<0.001)和0.985(P<0.001)，說明本方法具有很高的診斷價值；在最佳閾值下，雙重?zé)晒舛縋CR檢測豬鏈球菌的靈敏度和特異度達(dá)到89.6%和94.7%，檢測豬鏈球菌2型的靈敏度和特異度達(dá)到100%和94%，基本滿足臨床樣品檢測對靈敏度和特異度的要求。

成功建立了一種靈敏、特異和穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR方法，可同時及快速診斷豬鏈球菌和2型豬鏈球菌，非常適合大量臨床樣品的檢測。但我們的研究也顯示，在拷貝數(shù)低于普通PCR靈敏度的模板樣品中，兩方法的符合率只有54.5%和50%，這可能與普通PCR靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性有關(guān)，但也不能排除熒光定量PCR出現(xiàn)假陽性可能。要解決這一問題需要我們在下一步的研究中收集更多的臨床樣品進(jìn)行平行檢測，并引入第三種檢測方法進(jìn)行對比，探求熒光定量PCR方法在臨床應(yīng)用中Ct值的最佳陽性閾值，以獲得最高靈敏度及特異度的平衡點。

4 結(jié) 論

成功建立靈敏、特異和穩(wěn)定的雙重?zé)晒舛縋CR方法，實現(xiàn)了豬鏈球菌和2型豬鏈球菌同時及快速診斷，此方法非常適合大量臨床樣品的檢測，可應(yīng)用于臨床診斷和疫情監(jiān)控，為診斷和防控豬鏈球菌病提供技術(shù)支持。

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