響應面法優(yōu)化產(chǎn)二氫大豆苷元菌株發(fā)酵培養(yǎng)基

謝景龍，李曉斌，趙 芳，王晨晨，楊開倫

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院/新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】大豆苷元(Daidzein，4′，7-二羥基異黃酮)是異黃酮類化合物之一，具有抗氧化[1-2]和雌激素樣[3]等廣泛的生物活性作用，在臨床上主要用于抗癌[4-5]、預防骨質(zhì)疏松[6]、預防心血管疾病[7]等，有較高的應用價值。二氫大豆苷元(DHD)是大豆苷元在動物體內(nèi)經(jīng)特定的腸道菌群作用產(chǎn)生的代謝物，作為合成雌馬酚的前體物質(zhì)，與大豆苷元相比具有更高的生物活性[8]。因此，提高動物體內(nèi)二氫大豆苷元的含量對動物的健康和生長具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】大豆苷元在動物體內(nèi)代謝受各種因素的影響，包括飲食結(jié)構(gòu)[9]、性別[10]、年齡[11]以及種族[12]等，而起到?jīng)Q定性作用的是腸道微生物[13]。目前，已篩選出對大豆苷元具有降能力解的菌株，可降解大豆苷元產(chǎn)生DHD、雌馬酚等有效成分。由菌株來源的個體對大豆苷元的降解能力的差距可達到500倍左右[14]，使所篩選出的菌株對大豆苷元降解后的最終產(chǎn)物濃度范圍在0.04～12 μg/mL[15-16]。因此，對微生物培養(yǎng)基營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，以提高菌株大豆苷元轉(zhuǎn)化為DHD并進而提高雌馬酚的生物轉(zhuǎn)化量，是提高菌株生物轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)。【本研究切入點】響應面方法(RSM)是利用合理的試驗設計，通過試驗所得出的數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來建立因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析來尋找最優(yōu)參數(shù)，能充分考慮各因素之間的交互作用[17]。因而，將響應面法應用于微生物培養(yǎng)基的優(yōu)化工作有重要的意義。實驗室在前期的研究中，已從孕馬新鮮糞便中篩選出一株可降解大豆苷元產(chǎn)生DHD的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為乳酸片球菌HXBM408?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在腦浸心肉湯培養(yǎng)基(BHI)的基礎(chǔ)上進行補充不同碳源、氮源、生長因子和無機鹽，通過單因素試驗和響應面分析法對培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，確定培養(yǎng)基的最佳組成成分和補充量，從而提高DHD的產(chǎn)量，為廣泛使用DHD提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株

菌株HXBM408：乳酸片球菌，實驗室從新鮮孕馬糞便中分離，已保存至中國普通微生物菌種保藏管理中心，GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號MF992210。

1.1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液肉湯(BHI)營養(yǎng)成分為(g/L)：胰蛋白胨10.0 g，牛心浸粉17.5 g，D(+)葡萄糖2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2HPO42.5 g；底物：大豆苷元100.0 μmol/L。

1.1.3 試劑

大豆苷元(Sigma公司，純度為99%)，DHD(Sigma公司，純度為99%)，甲醇(色譜純，SK chemicals公司)，乙睛(色譜純，SK chemicals公司)，CO2(99.9%，米泉山下送氣公司)，高純氮氣(99.99%，米泉山下送氣公司)，葡萄糖、果糖、麥芽糖、蛋白胨、NH4NO3、VB1、VB2、VC、KH2PO4和MgSO4。

1.1.4 儀器

SHIMADZU高效液相色譜儀，包括：二元洗脫系統(tǒng)(LC-20AB)、SPD-20A紫外檢測器、CTO-lOAS柱溫控制箱；Hungate厭氧管；DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；超聲波清洗儀。

1.2 方 法

1.2.1 單因素試驗

在BHI基礎(chǔ)上補充10.0 g/L碳源(葡萄糖、果糖和麥芽糖)、5.0 g/L氮源(蛋白胨和NH4NO3)、1.0 g/L生長因子(VB1、VB2和VC)、1.0 g/L無機鹽(KH2PO4和MgSO4)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基BHI作為對照。選擇較優(yōu)的碳源、氮源、生長因子和無機鹽，分別補充5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 g/L碳源，1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 g/L的氮源，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的生長因子，0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 g/L的無機鹽，測定培養(yǎng)液中DHD濃度，以確定碳源、氮源、生長因子和無機鹽適宜的濃度范圍。

1.2.2 響應面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以碳源A：葡萄糖、氮源B：蛋白胨、生長因子C：VB1和無機鹽D：KH2PO4為主要因子，以DHD的濃度為響應值，進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設計。使用Design-Expert 8.0.6 Trial l分析軟件進行試驗設計以及結(jié)果分析。表1

表1 Box-Behnken因素水平(g/L)
Table 1 Box-Behnken factors levels

1.2.3 DHD的HPLC分析

菌株接種到培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)48 h后，取一定量的培養(yǎng)液，加入等量乙醚萃取，重復3次，合并萃取液，萃取液置于氮吹儀下吹干，加入100 μL甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存待HPLC檢測。

色譜柱：Welch Ulimate?AQ-C18，4.6×250 mm，5 μm；流動相：分別量取乙睛∶甲醇∶水按30∶20∶50(V/V/V)的比例混合，用0.45 μm濾膜抽濾，使用超聲波脫氣30 min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素選擇

研究表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加不同碳源，對DHD濃度的影響效果為葡萄糖>果糖>麥芽糖，碳源的選擇為葡萄糖；在氮源的選擇上，蛋白胨的效果優(yōu)于NH4NO3，氮源選擇蛋白胨；在生長因子的選擇上，VB1的效果優(yōu)于VB2、VC，生長因子選擇VB1；在無機鹽的選擇上，KH2PO4的效果優(yōu)于MgSO4，無機鹽選擇KH2PO4。圖1

圖1 不同碳源、氮源、生長因子和無機鹽下DHD濃度變化
Fig.1 Effect of different carbon sources,nitrogen sources,growth factors and inorganic salts on DHD concentration

培養(yǎng)基中添加不同葡萄糖的濃度對DHD產(chǎn)生的影響結(jié)果為，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內(nèi)添加10 g/L的葡萄糖，DHD的濃度達到最高，為0.25 μg/mL，隨著葡萄糖濃度的升高，DHD的濃度開始降低。圖2

圖2 不同葡萄糖濃度下DHD產(chǎn)生變化
Fig.2 Effect of glucose concentration on DHD production

2.1.2 蛋白胨濃度對DHD產(chǎn)生的影響

培養(yǎng)基中添加不同蛋白胨的濃度對DHD產(chǎn)生的影響結(jié)果為，隨著培養(yǎng)基中蛋白胨濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內(nèi)添加5 g/L的蛋白胨，DHD的濃度達到最高，為0.26 μg/mL，隨著蛋白胨濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)降低。圖3

2.1.3 VB1濃度對DHD產(chǎn)生的影響

培養(yǎng)基中添加不同VB1的濃度對DHD產(chǎn)生的影響結(jié)果為，隨著培養(yǎng)基中VB1濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內(nèi)添加0.4 g/L的VB1，DHD的濃度達到最高，為0.22 μg/mL。圖4

2.1.4 KH2PO4濃度對DHD產(chǎn)生的影響

培養(yǎng)基中添加不同KH2PO4的濃度對DHD產(chǎn)生的影響結(jié)果為，隨著培養(yǎng)基中KH2PO4濃度的升高，培養(yǎng)液中DHD的濃度出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在BHI培養(yǎng)基內(nèi)添加0.8 g/L的KH2PO4，DHD的濃度達到最高，為0.25 μg/mL。圖5

爸聽我這么說，沉默了。盡管我挑了最適合老年人用的款式，但長年累月的農(nóng)活讓他們的手指粗壯而笨拙，爸一個指頭摁下去，能同時覆蓋三個按鈕。

圖3 不同蛋白胨濃度下DHD產(chǎn)生變化
Fig.3 Effect of peptone concentration on DHD production

圖4 不同VB1濃度下DHD產(chǎn)生變化

圖5 不同KH2PO4濃度下DHD產(chǎn)生變化

2.2 響應面法優(yōu)化

2.2.1 響應面法試驗設計分組和結(jié)果(圖2)

2.2.2 響應面回歸統(tǒng)計

通過試驗結(jié)果進行回歸擬合后，以培養(yǎng)液中DHD的含量為響應值進行分析，得到葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4和VB1的添加量之間的回歸方程為：

Y=0.26+0.006 7A+0.025B+0.017C+0.012D-0.005AB+0.002 5AC+0.013AD-0.007 5BC+0.007 5BD-0.01CD-0.046A2-0.001 3B2-0.008 8C2-0.069D2。

對該模型各項進行方差分析，分析結(jié)果表明，回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.902 7，模型的P值小于0.000 1，表明回歸模型顯著，使用回歸方程對各因子與響應值之間的關(guān)系進行描述時，線性關(guān)系顯著，試驗方法可靠。失擬項不顯著，表明模型無失擬現(xiàn)象，該方程對試驗的擬合較好。此模型一次項B、C極顯著，D項差異顯著，A項不顯著，二次項A2、D2差異極顯著，B2、C2不顯著，交互項差異均不顯著。表3

表2 Box-Behnken試驗設計分組及結(jié)果
Table 2 Box-Behnkenv experiment design grouping and results

分組Groups因素 FactorsA(g/L)B(g/L)C(g/L)D(g/L)DHD濃度(μg/mL)15404080142154040801835604080224156040802451050206013610506060197105021001681050610018955040601410155040601111550410015121550410017131040208021141060208026151040608025161060608027175502080191815502080201955060802220155060802421104040601722106040602231050410018241060410024251050408025261050408027271050408026281050408026291050408024

表3 回歸統(tǒng)計分析結(jié)果
Table 3 Regression of statistical analysis results

來源Source平方和SumofSquares自由度df均方MeanSquareF值FValueProb>FP-value顯著性Significance模型005501400039116<00001??A0000510000515702306B00075100075220900003??C0003310003398200073??D0001610001648100457?AB0000110000102905959AC0000031000003007407901AD0000610000618401963BC0000210000206604292BD0000210000206604292CD0000410000411802961A2001401001404101<00001??B20000011000001003408564C20000510000514902423D2003101003109052<00001??殘差 Residual000481400048失擬 Lackoffit00042100004232601332不顯著純誤差 Pureerror00005400005總和 CorTotal0069628

2.2.3 響應面圖形和等高線圖形

觀察四個因素交互作用的響應面圖形和等高線圖形，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每兩個因素的響應面圖中均有一個最佳交互水平。圖6～11

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和蛋白胨之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，蛋白胨濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升的趨勢；當?shù)鞍纂藵舛裙潭〞r，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響先升高再降低。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿A軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于葡萄糖的濃度(A)。圖6

圖6 葡萄糖和蛋白胨之間的等高線圖及響應面
Fig.6 The Contour plots and Response surface of glucose and peptone

研究表明，響應曲面開口向下，表明葡萄糖和VB1之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，VB1對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響出現(xiàn)較為緩慢升高的趨勢；當VB1濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響為先升高后降低的趨勢。觀察等高線圖，沿C軸方向等高線較密集，且沿A軸方向的等高線較稀疏，表明VB1濃度(C)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于葡萄糖的濃度(A)。圖7

圖7 葡萄糖和VB1之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和蛋白胨之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢；當KH2PO4濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢。觀察等高線圖，圖形較圓，且沿A軸方向和D軸方向的等高線密集程度相當，表明葡萄糖濃度(A)和KH2PO4濃度(D)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響相差較小，交互作用不顯著。圖8

圖8 葡萄糖和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明蛋白胨和VB1之間有交互作用，但圖形較為平緩，表明交互作用不顯著。當?shù)鞍纂藵舛裙潭〞r，VB1濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈緩慢上升；VB1濃度固定時，蛋白胨濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈緩慢上升。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿C軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于VB1的濃度(C)。圖9

圖9 蛋白胨和VB1之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明葡萄糖和KH2PO4之間有交互作用。當葡萄糖濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈先升高后降低的趨勢；當KH2PO4濃度固定時，葡萄糖濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升。觀察等高線圖，沿B軸方向等高線較密集，且沿D軸方向的等高線較稀疏，表明蛋白胨濃度(B)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于KH2PO4的濃度(D)。圖10

圖10 蛋白胨和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

研究表明，響應曲面開口向下，說明VB1和KH2PO4之間有交互作用。當VB1濃度固定時，KH2PO4濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響呈逐漸上升的趨勢；KH2PO4濃度固定時，VB1濃度對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響先升高再降低。觀察等高線圖，沿C軸方向等高線較密集，且沿D軸方向的等高線較稀疏，表明VB1濃度(C)對培養(yǎng)液中DHD濃度最大值的影響高于KH2PO4的濃度(D)。圖11

圖11 VB1和KH2PO4之間的等高線圖及響應面

2.3 響應面優(yōu)化結(jié)果驗證試驗

根據(jù)響應面法優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的結(jié)果，得出培養(yǎng)基最佳組成成分為BHI腦浸心液38 g/L、葡萄糖10.22 g/L、蛋白胨6.00 g/L、VB10.49 g/L、KH2PO40.82 g/L，培養(yǎng)液中DHD的濃度的預測值為0.28 μg/mL。驗證試驗得到DHD的濃度為0.27 μg/mL，與預測值接近，表明該模型可較好的預測實際情況。此外，培養(yǎng)基在優(yōu)化后與優(yōu)化前相比，DHD的濃度提高了1.32倍。表4

表4 驗證試驗結(jié)果
Table 4 The result of verify experiment

條件ConditionsDHD(μg/mL)123平均數(shù)Average優(yōu)化前Beforeoptimization025026029027優(yōu)化后Afteroptimization009013010011

3 討 論

大豆苷元在動物腸道內(nèi)經(jīng)過特定細菌的作用，首先降解為二氫大豆苷元，之后轉(zhuǎn)化為雌馬酚，而這個過程中需要多種營養(yǎng)物質(zhì)的參與。研究表明，大豆苷元的降解與腸道內(nèi)的營養(yǎng)成分有關(guān)，在碳水化合物含量較高的情況下，腸道細菌對大豆苷元的降解能力較強。Rowland等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在排泄物中存在大豆苷元代謝產(chǎn)物的個體，55%的能量由碳水化合物提供，顯著高于排泄物中不存在大豆苷元代謝產(chǎn)物的個體，能量來源的47%為碳水化合物，表明可降解大豆苷元的個體能量來源更依賴于碳水化合物。研究在培養(yǎng)基中補充葡萄糖、果糖和麥芽糖等不同碳源對DHD產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，葡萄糖、果糖和麥芽糖均可提高DHD的含量，結(jié)果與于卓騰等[19]研究一致，在培養(yǎng)基中補充不同的碳源，均可提高大豆苷元的降解能力。其中葡萄糖作為單糖中微生物最容易利用的碳源，對DHD產(chǎn)生的影響高于果糖和麥芽糖。隨著葡萄糖濃度的升高，DHD濃度出現(xiàn)先升高后降低趨勢，當葡萄糖補充濃度為10 g/L時，DHD濃度達到最高值，為0.25 μg/mL。之后隨著葡萄糖濃度的升高，DHD濃度出現(xiàn)下降，可能是由于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過高，對細菌生長造成碳脅迫，高濃度的葡萄即使給細菌生長提供充足的碳源，但也會造成胞外滲透壓升高，從而減緩細菌生長[20]。氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，是微生物生長繁殖所需的主要營養(yǎng)物[21]。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中補充蛋白胨對培養(yǎng)液中DHD濃度的影響高于NH4NO3，可能是由于蛋白胨水解后，可產(chǎn)生大量低級肽和游離的氨基酸，更容易被微生物利用。郭遠洋等[20]在培養(yǎng)菌株LH-52時以蛋白胨為氮源，結(jié)果顯示隨著蛋白胨添加濃度升高，菌株對大豆苷元降解能力呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢。試驗結(jié)果顯示，當?shù)鞍纂说难a充量超過5 g/L時，DHD濃度出現(xiàn)降低的趨勢，與郭遠洋等研究結(jié)果相反，可能與試驗碳源濃度較低有關(guān)。由于試驗在碳源濃度不變的情況下，隨著蛋白胨的濃度升高，使培養(yǎng)基中C/N比降低，導致培養(yǎng)基中的滲透壓升高，細菌對氮源利用力降低，是試驗大豆苷元降解能力下降的原因[22]。

微生物在正常的生長過程中不能僅用簡單的碳、氮源自行合成的有機物，需要生長因子的參與，合成供微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)。VB1被厭氧微生物利用后，參與α-酮轉(zhuǎn)移反應，可以穩(wěn)定羰基碳上負電荷的積累，促進磷酸酮酶反應[23]。此外，由于VB1可以以其衍生的脫羧輔酶的形式參與細胞酮酸代謝，這種脫羧輔酶是碳水化合物代謝中幾種必需的催化成分，因而動物機體對碳水化合物的需求量越高，VB1需求量也會升高[24]。因此，在培養(yǎng)基中添加VB1，可促進微生物對于糖的利用。在試驗中，培養(yǎng)基中補充0.4 g/L的VB1時，培養(yǎng)液中DHD濃度達到0.22 μg/mL，但隨著VB1濃度升高到1.0 g/L時，培養(yǎng)液中的濃度降低至0.06 μg/mL，造成的原因可能是VB1過多，導致液體滲透壓改變，從而阻礙到細菌的生長[25]。無機鹽離子可調(diào)節(jié)細胞膜的通透性，控制水分，維持正常滲透壓和酸堿平衡。而培養(yǎng)基中補充KH2PO4，不僅可以提供鉀源和磷源，而且可以維持培養(yǎng)基中pH值的穩(wěn)定，從而促進細菌的生長代謝[26]，可能也是研究在培養(yǎng)基內(nèi)補充KH2PO4提高DHD濃度的原因。

目前，對于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的主要方法是單因素試驗和正交試驗設計法。但采用單因素試驗時，忽略了考察因素之間的交互作用，導致結(jié)果往往不是最佳的優(yōu)化條件。正交試驗可同時考慮幾種因素，尋求最佳組合，而無法再整個區(qū)域找到一點最優(yōu)值。而通過響應面分析方法卻可以完成這些需求，因此，在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基有著重要的應用[27]。試驗通過單因素試驗在確定了主要因素后，通過響應面分析可充分考慮到葡萄糖、蛋白胨、VB1和KH2PO4之間的交互作用，通過響應曲面尋求最優(yōu)值，使培養(yǎng)液中DHD的濃度較優(yōu)化前提高了1.32倍。姜雪等[28]通過響應面分析法對于可降解大豆苷元產(chǎn)生雌馬酚的菌株HY-1和HY-2培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，使培養(yǎng)中雌馬酚的含量較為優(yōu)化前提高了1.45倍，效果高于試驗，可能和菌株以及培養(yǎng)基中添加的營養(yǎng)成分種類有關(guān)，試驗所用的菌株可降解大豆苷元產(chǎn)生DHD，而菌株HY-1和HY-2可進一步降解DHD產(chǎn)生雌馬酚。

4 結(jié) 論

在以BHI腦浸心液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的情況下，通過單因素試驗確定了主要因素為葡萄糖、蛋白胨、VB1和KH2PO4，并明確了主要因素的適宜濃度范圍。通過Box-Behnken中心組合試驗設計，采用響應面法進行回歸分析，確定培養(yǎng)基中的最佳組成成分為38 g/L BHI、10.22 g/L的葡萄糖、6.00 g/L的蛋白胨、0.49 g/L的VB1、0.82 g/L的KH2PO4，可使培養(yǎng)液中DHD的濃度接近預測值0.28 μg/mL，與優(yōu)化前相比，DHD的濃度提高了1.32倍。

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