基于“痛瀉要方”探討防風(fēng)對(duì)TNBS 誘導(dǎo)大鼠UC 結(jié)腸TLR-4及外周血中TNF-α、IL-1β的影響

郭軍雄，馬麗，汪斌，閆立國

(1.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 張掖 734000)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)作為一種常見的非特異性腸道炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為UC的發(fā)病主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo)并與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)[1]。大部分UC可伴終身，嚴(yán)重威肋到患者的生活質(zhì)量，且有一定的癌變風(fēng)險(xiǎn)，迄今尚無特效的治療方法，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。中醫(yī)治療 UC優(yōu)勢(shì)明顯，其組方中大多注重風(fēng)藥的應(yīng)用，但治療機(jī)制不明。前期研究表明[2],“痛瀉要方”配伍風(fēng)藥具有減輕UC模型大鼠結(jié)腸組織炎性反應(yīng)，減緩黏膜充血水腫來促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性UC大鼠潰瘍愈合的作用。本課題組擬在前期研究基礎(chǔ)上，觀察防風(fēng)、痛瀉要方、痛瀉要方祛防風(fēng)對(duì)UC大鼠結(jié)腸黏膜TOLL 樣受體4(TLR-4)，血清白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)Wistar大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001；動(dòng)物設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑

痛瀉要方制備：依據(jù)《景岳全書·卷五十四》中痛瀉要方藥物組成及劑量的比例確定。藥材由河西學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥房提供，將上述藥物洗凈，浸泡40 min，加水煎煮兩次，合并煎液，過濾，95℃水浴濃縮至每毫升含生藥0.75 g。同樣的方法制備痛瀉要方去防風(fēng)和防風(fēng)水煎劑，藥物最終濃度相當(dāng)每毫升含生藥0.75 g。以上藥物制成后，分裝，高壓滅菌消毒，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

SASP溶液：選取上海信誼天平藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的柳氮磺胺吡啶腸溶片(批號(hào)：09140806)；規(guī)格：0.25 g/片，用研缽研碎，調(diào)配至0.03 g/mL濃度的混懸液備用。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，批號(hào)：2008-16-2，sigma公司，由北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司提供；無水乙醇，批號(hào):20140501，天津市化學(xué)試劑工廠提供；腫瘤壞死因子(TNF-α)放射免疫試劑盒，批號(hào)：20151101；白介素-6(IL-6)放射免疫藥盒，批號(hào)：20151015；白介素-1β(IL-1β)放射免疫藥盒，批號(hào)：20151101，以上測(cè)試盒均購自北京華英生物技術(shù)研究所；大鼠抗COX-2免疫組化試劑盒，批號(hào)：AE062452；大鼠抗TLR4免疫組化試劑盒，批號(hào)：AE080653,以上測(cè)試盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP-9001生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG免疫組化檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：15121A01；濃縮型DNA試劑盒，批號(hào)：K146712F，以上測(cè)試盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 主要儀器

TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；XK96-A快速混勻器，北京維欣儀奧科技發(fā)展有限公司；GB11240-89 GSY電熱恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠；r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng),成都泰盟科技有限公司；MiE圖像處理系統(tǒng)，山東易創(chuàng)電子有限公司；日本OLYMPUS-CX21型顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組造模

將72只大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、防風(fēng)組、痛瀉要方祛防風(fēng)組、痛瀉要方組、SASP組，每組12只，雌雄各半。各組大鼠正常飼養(yǎng)1周后，除空白對(duì)照組外，其余各組采用TNBS/乙醇溶液灌腸結(jié)合束縛和飲食失節(jié)法復(fù)制肝郁脾虛型UC模型：造模組大鼠每日不定時(shí)束縛四肢，限制其自由活動(dòng)，每日4 h左右，隔日進(jìn)食。束縛1周后，禁食(不禁水)24 h后用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kgTNBS和50%乙醇0.25 mL)溶液，用直徑2 mm聚丙烯管緩慢推入距肛門約7～8 cm深的結(jié)腸處，再注入約0.4 mL空氣，提取大鼠尾巴保持倒立1 min后，平躺至麻醉清醒后正常喂養(yǎng)?？瞻捉M大鼠肛門內(nèi)約8 cm處按照上述方法給予等體積生理鹽水灌腸。

2.2 給藥及取材

等效劑量以成人痛瀉要方常規(guī)劑量的10倍計(jì)算，各組于造模成功后第2 d開始灌胃，痛瀉要方組、痛瀉要方祛防風(fēng)組按生藥7.5 g/kg劑量灌胃?？瞻讓?duì)照組與模型組每日給予等體積生理鹽水，SASP組按0.3 g/kg劑量灌胃，1次/d，連續(xù)21 d后取材。各組大鼠禁食不禁水24 h后，乙醚麻醉后于股動(dòng)脈采血5 mL，37℃水中放置30 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清4℃冰箱保存，待測(cè)血清IL-1β、TNF-α。采血后脫頸處死大鼠，快速剖取病變結(jié)腸5～8 cm，肉眼觀察結(jié)腸損傷并評(píng)分，部分結(jié)腸組織以4%多聚甲醛固定，用于免疫組化法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

血清IL-1β、TNF-α由北京華英生物技術(shù)研究所檢測(cè)；結(jié)腸黏膜TLR4采用免疫組化(SP法)，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.4 TLR4蛋白表達(dá)結(jié)果及測(cè)量方法

TLR4蛋白表達(dá)以核膜或胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性，陽性染色細(xì)胞小于或等于10%定為陰性(-)，10%～30%為弱陽性(+)，30%～50%為陽性(++)，大于50%為強(qiáng)陽性(+++)。并采用BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像免疫組化分析系統(tǒng)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量陽性細(xì)胞平均積分吸光度，吸光度越大蛋白表達(dá)強(qiáng)，反之則表達(dá)弱。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)TNBS/乙醇溶液灌腸當(dāng)天開始出現(xiàn)稀便，活動(dòng)逐漸減少，肛周污濁，毛色發(fā)黃無澤且被糞便沾染，部分大鼠肉眼可見血便，伴有拖尾、易撕咬、喜扎堆等。防風(fēng)和痛瀉要方祛防風(fēng)組大鼠癥狀改善緩慢，毛色仍顯晦暗無澤，扎堆、稀便及血便緩解不明顯；痛瀉要方和SASP組大鼠癥狀改善明顯，肛周干凈，毛色光亮，糞便呈灰褐色顆粒狀，基本同空白對(duì)照組。

3.2 各組UC大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量的比較

模型組大鼠血清TNF-α水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；防風(fēng)組、痛瀉要方祛防風(fēng)組、痛瀉要方組和SASP組TNF-α含量均低于模型組，其中痛瀉要方組和SASP組有顯著差異(P<0.05)。

表1 各組UC大鼠血清TNF-α含量的比較

注：與空白對(duì)照組相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；與模型組比較,ΔP<0.05

3.3 各組UC大鼠血清白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量的比較

模型組大鼠血清IL-1β水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；防風(fēng)組、痛瀉要方祛防風(fēng)組、痛瀉要方組和SASP組IL-1β含量均低于模型組，尤以痛瀉要方組和SASP組最為顯著(P<0.01)。

表2 各組UC大鼠血清IL-1β含量的比較

注：與空白對(duì)照組相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；與模型組比較,ΔΔP<0.01

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4蛋白免疫組化結(jié)果

TLR4蛋白表達(dá)于大鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層，空白對(duì)照組TLR4呈陰性(見圖1)；模型組TLR4呈強(qiáng)陽性(見圖2)；防風(fēng)組TLR4呈陽性(見圖3)；痛瀉要方去防風(fēng)組TLR4呈陽性(見圖4)；痛瀉要方組TLR4呈弱陽性(見圖5)；SASP組TLR4呈弱陽性或陰性(見圖6)。

圖1 空白對(duì)照組結(jié)腸(×40)

圖2 模型組結(jié)腸(×40)

圖3 防風(fēng)組結(jié)腸(×40)

圖4 痛瀉要方去防風(fēng)組 結(jié)腸(×40)

圖5 痛瀉要方組結(jié)腸(×40)

圖6 SASP組結(jié)腸(×40)

3.5 各組大鼠結(jié)腸黏膜TLR4蛋白陽性細(xì)胞平均積分光密度比較

模型組大鼠結(jié)腸黏膜TLR4蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度高于空白對(duì)照組；防風(fēng)組、痛瀉要方祛防風(fēng)組、痛瀉要方組和SASP組結(jié)腸黏膜TLR4蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度均低于模型組，尤以痛瀉要方組和SASP組最為顯著(P<0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸黏膜TLR4蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞平均積分光密度值

注：與空白對(duì)照組相比,▲▲P<0.01，▲P<0.05；與模型組比較,ΔΔP<0.01，ΔP<0.05

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為UC是一種與免疫直接相關(guān)的腸道疾病，主要由免疫反應(yīng)介導(dǎo)并和遺傳、環(huán)境因素密切相關(guān)。TOLL樣受體4(toll-1ike receptor 4，TLR4)是介導(dǎo)天然免疫的重要的跨膜蛋白受體，與宿主細(xì)胞對(duì)各種微生物致病原的識(shí)別有關(guān)。TLR4能特異性識(shí)別并結(jié)合病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，經(jīng)激活其下游MyD88依賴性及非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)分子，誘導(dǎo)核因子-κB(NF-κB)，轉(zhuǎn)錄因子AP-1激活，致使效應(yīng)細(xì)胞分泌IL-1，IL-6，IL-8，TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子，介導(dǎo)腸黏膜的免疫反應(yīng)[3-4]。同時(shí)，IL-1、TNF-α和IFN-γ等又可促使腸上皮細(xì)胞的TLR4和其輔助蛋白MD-2的表達(dá)增加，進(jìn)而觸發(fā)和加重潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病[5]。故抑制NF-κB信號(hào)通路上游TLR4的表達(dá)可致下游NF-κB所介導(dǎo)的TNF-α，IL-1β等炎癥因子表達(dá)和最終合成分泌的減少。有研究證實(shí)[6]，TLR4在正常的結(jié)腸黏膜中呈微量表達(dá),而在UC的結(jié)腸黏膜中則呈現(xiàn)異常的高表達(dá)。TNF-α是按特定空間排布的3個(gè)單體堆疊成的三聚體，是目前已知的與UC發(fā)病關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子之一。主要是由受到抗原刺激的單核—巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有廣泛生物學(xué)活性。TNF-α能通過參與激活中性粒細(xì)胞和上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、促進(jìn)肉芽腫的形成。同時(shí)還能加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，刺激IL-8,IL-1等細(xì)胞因子合成與釋放，產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大[7]。IL-1β是一種主要由單核—巨噬細(xì)胞分泌的多肽類細(xì)胞因子，可激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)IL-2受體表達(dá)以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)而上調(diào)免疫功能。更為主要的是IL-1β促使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化及脫顆粒,促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放前列腺素、血栓素、血小板活化因子等,增加上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性而炎癥活性作用。另外，IL-1β還可通過誘導(dǎo)釋放H2O2，影響Ca2+的釋放，導(dǎo)致UC患者結(jié)腸平滑肌收縮功能紊亂而發(fā)生腹瀉等癥狀[8]。

本研究將中醫(yī)學(xué)的診療特點(diǎn)辨證論治列入假設(shè)范疇，故在采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌腸法基礎(chǔ)上，加入束縛刺激合并飲食失節(jié)復(fù)合刺激法復(fù)制肝郁脾虛型UC大鼠。本研究結(jié)果顯示：TNBS誘導(dǎo)大鼠UC結(jié)腸黏膜TLR4表達(dá)及血清TNF-α、IL-1β含量明顯增加。運(yùn)用中醫(yī)經(jīng)典名方進(jìn)行干預(yù)治療，痛瀉要方是臨床治療肝旺脾虛所致腹瀉的代表方劑，方中白術(shù)苦甘而溫，補(bǔ)脾燥濕以治土虛，為君藥；白芍酸寒，養(yǎng)血柔肝，緩急止痛，為臣藥；陳皮辛苦溫，理氣醒脾和胃，為佐藥；配伍少量“風(fēng)藥”防風(fēng)，專入肝脾二經(jīng)，辛散肝郁，甘舒脾氣，且風(fēng)藥其性輕靈香燥，引導(dǎo)藥物到達(dá)病變部位，發(fā)揮勝濕而止瀉之功，故兼俱佐使之用。臨床治療UC，配伍防風(fēng)和去掉防風(fēng)療效大不相同。本研究發(fā)現(xiàn)：痛瀉要方全方明顯減弱大鼠UC結(jié)腸黏膜TLR4蛋白表達(dá)，減低大鼠血清TNF-α、IL-1β的濃度。因此，我們推測(cè)痛瀉要方治療UC的可能機(jī)制是通過抑制NF-κB信號(hào)通路上游TLR4的表達(dá)，介導(dǎo)了下游TNF-α，IL-1β等炎癥因子表達(dá)和最終合成分泌的減少，達(dá)到糾正了機(jī)體的異常免疫。本研究也從在一定程度上說明痛瀉要方全方對(duì)UC大鼠的治療作用明顯優(yōu)于缺防風(fēng)方，證實(shí)了防風(fēng)在痛瀉要方中發(fā)揮著不可替代的佐助作用。

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