姜黃素對過度訓(xùn)練大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用及其機(jī)制*

胡 戈， 曹 卉， 周海濤， 曹建民， 郭 嫻， 牛衍龍， 包欣悅， 任 奕， 李 倩， 張 濤， 趙佳暉

(1. 北京體育大學(xué)， 北京 100084; 2. 北京聯(lián)合大學(xué)， 北京 100023; 3. 北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191; 4. 贛南醫(yī)學(xué)院, 江西 贛州 341000)

科學(xué)、合理的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以有效提高運(yùn)動(dòng)能力和健康水平。但在實(shí)際過程中，人們?yōu)榱俗非蟪?fù)荷訓(xùn)練后的超量恢復(fù)，常常忽視兩者之間的平衡關(guān)系，引發(fā)過度訓(xùn)練綜合癥。近年來，馬拉松等高強(qiáng)度極限運(yùn)動(dòng)已不再為專業(yè)運(yùn)動(dòng)員“專屬”，更多民眾參與其中，享受極限運(yùn)動(dòng)帶來的健康生活方式和快樂。部分愛好者由于對馬拉松等高強(qiáng)度極限運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)及運(yùn)動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)知不足，缺乏科學(xué)、專業(yè)的指導(dǎo)和科學(xué)訓(xùn)練，缺乏對自身能力和身體狀況的了解，盲目挑戰(zhàn)和超越自我，受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、訓(xùn)練周期、恢復(fù)時(shí)間、重視程度等多種因素影響，“跑馬”人群過度訓(xùn)練綜合癥及運(yùn)動(dòng)性腎損傷頻發(fā)[1]，已引起社會(huì)及相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的高度重視。研究表明過度訓(xùn)練可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，破壞腎臟局部組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎臟組織細(xì)胞凋亡增加，不僅不利于腎臟機(jī)能的提高，反而易造成多種病理及功能改變[2-4]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是體內(nèi)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，通過識(shí)別靶基因啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)，調(diào)節(jié)下游眾多抗氧化酶的基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化作用。Nrf2也可與B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein，Bcl-2)抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡[5]。姜黃素作為一種多酚類化合物，具有抗氧化、抑炎及抑制腫瘤生長等多種藥理作用[6]。本團(tuán)隊(duì)前期研究和其他學(xué)者的研究均表明，姜黃素對大鼠運(yùn)動(dòng)性腎損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究，通過觀察腎臟組織病理學(xué)改變并檢測腎臟損傷標(biāo)志物，結(jié)合腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)以及細(xì)胞凋亡水平變化，探討姜黃素通過緩解過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激，進(jìn)而降低大鼠腎臟細(xì)胞凋亡水平的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠63只(49 d齡)，體重(218.4±10.7 )g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供(生產(chǎn)合格證編號(hào)SCXK(京)2016-0010)。北京體育大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度(22±2)℃，相對濕度55%～75%，正常晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)大鼠首先進(jìn)行4 d適應(yīng)性飼養(yǎng)，然后以20 min/d的運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行3 d適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，剔除無法完成適應(yīng)性訓(xùn)練的3只大鼠，剩余60只大鼠隨機(jī)分為安靜對照組(C組，12只)、過度訓(xùn)練組(OM組，24只)和姜黃素+過度訓(xùn)練組(COM組，24只)。

1.2 訓(xùn)練方案與營養(yǎng)干預(yù)

OM、COM組采用8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，具體方案[9-11]見圖1。訓(xùn)練過程中，若發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)力竭表現(xiàn)，即沉入水下10 s不能上浮，則托出水面休息5～10 min后再繼續(xù)進(jìn)行游泳訓(xùn)練，直至完成訓(xùn)練方案。

姜黃素購自陜西源泰生物科技公司(純度>99%，批號(hào)17012571)，用0.5%羧甲基纖維素納配成混懸液，4℃存放備用。C組常規(guī)飼養(yǎng)，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù)。根據(jù)文獻(xiàn)[8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定訓(xùn)練期間COM組大鼠姜黃素干預(yù)劑量為200 mg/(kg·d)，灌胃體積為5 ml/kg；其他組灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素納。采用專業(yè)灌胃器每天灌胃一次。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材

訓(xùn)練結(jié)束后，受訓(xùn)練強(qiáng)度、頻度、負(fù)重情況、恢復(fù)時(shí)間等因素影響，OM、COM組大鼠出現(xiàn)意外死亡，分別剩余11只和14只。末次訓(xùn)練結(jié)束后24 h，各組大鼠乙醚適度麻醉，頸總動(dòng)脈取血，37℃自然凝固，待血清出現(xiàn)后放入冰箱24 h。4℃，3 000 r/min離心10 min，分離制備血清，置-20℃冰箱中保存待測。取左側(cè)腎臟浸入4%多聚甲醛固定液中。取右側(cè)腎臟，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，準(zhǔn)確稱量重量后按照組織塊重量W(g)/勻漿介質(zhì)V(ml)為1 / 9 的比例加入PBS緩沖液，以玻璃勻漿器在冰上充分研磨后進(jìn)行超聲破碎，5 000 r/min離心5 min取上清待測。

Fig.1Swimming training program of rats

swimming time (min) * load percentage of the body weight (body weight %) * frequency of training

1.4 指標(biāo)測試方法及儀器

各指標(biāo)的測定和計(jì)算嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用儀器包括Allegra 25R臺(tái)式高速離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)，Wellscan MK3 酶標(biāo)儀(美國雷博公司)，Pannoramic MIDI全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng)(匈牙利3D HISTECH公司)，r-911全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司)，722分光光度計(jì)(上海分析儀器三廠)，NR-B17CC超低溫冰箱(日本松下)，ISO9001電子天秤(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DY89-Ⅱ電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，LEICA RM2016病理切片機(jī)(德國RM公司)。

1.4.1 腎臟病理變化評價(jià) 將腎臟從固定液中取出，流水洗滌12 h，梯度酒精脫水后透明，石蠟包埋，制成4 μm切片，HE染色。在400倍光鏡下，觀察腎臟組織病理變化。

1.4.2 腎臟細(xì)胞凋亡檢測 采用Tunel法檢測細(xì)胞凋亡。石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)修復(fù)、破膜后，將適量末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合，覆蓋組織。切片平放于濕盒內(nèi)，37℃ 孵育2 h后加入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min。適量converter-POD 37℃孵育30 min。洗滌，DAB顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。試劑盒由瑞士Roche公司提供。

1.4.3 蛋白免疫組化分析 采用免疫組化法檢測Nrf-2、血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)、Bcl-2、Bax表達(dá)情況。石蠟切片脫蠟至水經(jīng)抗原修復(fù)后，加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進(jìn)行血清封閉，隨后加入一抗、二抗，進(jìn)行DAB顯色，Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片?？贵w由武漢谷歌生物科技有限公司提供。

1.4.4 H-score評分方法 采用病理切片掃描儀將每張切片內(nèi)陽性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值，應(yīng)用公式計(jì)算H-score從而對其進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞，其中細(xì)胞核呈深棕色為強(qiáng)陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對每個(gè)組織點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別分析出強(qiáng)陽性、中度陽性、弱陽性及陰性的面積(單位：像素)和陽性百分比，最后進(jìn)行H-score評分評定。H-score=(弱陽性細(xì)胞密度×1)+(中陽性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽性細(xì)胞密度×3)。

1.4.5 其他指標(biāo)測試方法 采用放射免疫法測定血清睪酮(testosterone，T)和皮質(zhì)酮(corticosterone，Cor)，Jaffe 苦味酸法測定血清肌酐(creatinine，Cr)，二乙酰-肟法測定血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，酶聯(lián)免疫吸附法測定總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。以上試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 過度訓(xùn)練對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

光鏡下觀察顯示，C組大鼠腎臟組織形態(tài)正常，腎小球無淤血、變性和水腫，腎小管管腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)管型；OM組大鼠腎臟組織形態(tài)發(fā)生改變，腎小球出現(xiàn)淤血，腎小管嚴(yán)重?fù)p傷，上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫、空泡變性和管腔擴(kuò)張現(xiàn)象，管腔中出現(xiàn)多種管型；COM組大鼠腎臟組織形態(tài)損傷程度輕于OM組，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫、空泡變性和管腔擴(kuò)張，無蛋白管型和細(xì)胞管型(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。

2.2 過度訓(xùn)練對大鼠腎臟損傷指標(biāo)的影響

與C組相比，OM組血清Cr和BUN水平均顯著升高(P<0.01)。與OM組相比，COM組血清Cr和BUN水平均顯著降低(P<0.05，表1)。

GroupnCr(μmol/L)BUN(mmol/L)C1228.81±7.528.10±1.22OM1182.09±11.62??14.90±1.85??COM1460.11±10.01#12.87±1.16#

C： Control group; OM： Overtraining group; COM： Curcumin + overtraining group； Cr： Creatinine; BUN： Blood urea nitrogen

**P<0.01vsC group;#P<0.05vsOM group

2.3 過度訓(xùn)練對大鼠血清睪酮/皮質(zhì)酮的影響

與C組相比，OM組血清T水平顯著降低(P<0.01)，Cor水平顯著升高(P<0.01)。與OM組相比，COM組血清T水平顯著升高(P<0.01)，Cor水平顯著降低(P<0.01)。組間T/Cor比值變化與T變化一致(表2)。

GroupnT(ng/ml)Cor(ng/ml)T/Cor(10-2)C121.82±0.7123.81±3.918.34±4.37OM110.50±0.12??45.95±6.93??1.14±0.44??COM141.22±0.66##30.11±8.41##4.40±4.26##

C： Control group; OM： Overtraining group; COM： Curcumin + overtraining group； T： Testosterone; Cor： Corticosterone

**P<0.01vsC group;##P<0.01vsOM group

2.4 過度訓(xùn)練對大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

OM組T-AOC和SOD活性均顯著低于C組(P<0.01)，COM組T-AOC和SOD活性均顯著高于OM組(P<0.01)。MDA濃度，OM組顯著高于C組(P<0.01)，COM組顯著低于OM組(P<0.05，表3)。

GroupnT-AOC(U/mg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)C1236.44±3.5669.77±3.146.04±1.03OM1120.28±3.53??34.58±2.68??14.74±2.46??COM1424.84±4.16##38.42±4.17##12.85±2.02#

C： Control group; OM：Overtraining group; COM： Curcumin + overtraining group； T-AOC： Total antioxidant capacity; SOD： Superoxide dismutase; MDA： Malondialdehyde

**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOM group

2.5 過度訓(xùn)練對大鼠腎臟細(xì)胞凋亡水平及Bcl-2/Bax表達(dá)水平的影響

腎臟細(xì)胞凋亡水平，OM組顯著高于C組(P<0.01)，COM組顯著低于OM組(P<0.05)。腎臟Bcl-2表達(dá)，OM組顯著低于C組(P<0.01)，COM組顯著高于OM組(P<0.05)。腎臟Bax表達(dá)，OM組顯著高于C組(P<0.01)，COM組顯著低于OM組(P<0.01)。組間Bcl-2/Bax比值變化與Bcl-2表達(dá)變化一致(表4，圖3，圖4，圖3見彩圖頁Ⅱ，圖4見彩圖頁Ⅲ)。

Groupn Renal apoptosisBcl-2BaxBcl-2/BaxC1260.60±16.54112.06±8.0063.96±6.541.76±0.16OM11120.97±6.90??92.16±5.45??99.23±8.96??0.93±0.10??COM14107.91±11.51#97.70±5.96#79.21±11.58##1.25±0.18##

C： Control group; OM： Overtraining group; COM：Curcumin + overtraining group； Bcl-2： B cell lymphoma-2 protein; Bax： Bcl-2 associated X protein

**P<0.01vsC group;#P<0.05,##P<0.01vsOM group

2.6 過度訓(xùn)練對大鼠腎臟Nrf-2和HO-1表達(dá)水平的影響

OM組Nrf2表達(dá)水平與C組無顯著差異(P> 0.05)，COM組顯著高于OM組(P<0.05)。OM組HO-1表達(dá)水平顯著低于C組(P<0.05)，COM組顯著高于OM組(P<0.05，表5，圖5，圖5見彩圖頁Ⅲ)。

GroupnNrf2HO-1C1277.86±5.1380.13±5.36OM1176.28±8.4872.51±9.16?COM1484.50±9.16#80.47±7.54#

C： Control group; OM： Overtraining group; COM： Curcumin + overtraining group； Nrf2： Nuclear factor erythroid 2-related factor 2; HO-1： Heme oxygenase-1

*P<0.05vsC group;#P<0.05vsOM group

3 討論

腎臟是保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要臟器，作為高灌注器官，對缺血、缺氧十分敏感。研究表明運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，全身血流分配發(fā)生明顯改變，肌肉組織血流量迅速增加，腎臟血流量急劇下降，下降幅度最高可達(dá)腎血流總量的40%～75%。運(yùn)動(dòng)終止后，血液從骨骼肌等運(yùn)動(dòng)器官回流到腎臟，伴隨缺血/再灌注過程，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，線粒體功能出現(xiàn)障礙，自由基產(chǎn)生增多，SOD等抗氧化酶活性下降，機(jī)體抗氧化能力降低，無法有效的清除自由基，導(dǎo)致自由基過量堆積。過量的自由基會(huì)進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激過程，引發(fā)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷，觸發(fā)凋亡信號(hào)[12-13]，細(xì)胞凋亡加劇進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)、功能受損[14-15]。

T/Cor比值是監(jiān)控運(yùn)動(dòng)者機(jī)能狀況的敏感指標(biāo)，可以有效反映機(jī)體合成和分解代謝的平衡情況，本研究中OM組大鼠T/Cor比值較C組下降達(dá) 86.33%，超過文獻(xiàn)中報(bào)道的過度訓(xùn)練診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，證明本研究成功建立過度訓(xùn)練動(dòng)物模型。Cr和BUN是明確腎臟損傷程度的常用指標(biāo)[17-19]。本研究中，OM組大鼠血清Cr和BUN較C組顯著升高，同時(shí)腎臟組織出現(xiàn)一系列病理學(xué)改變，進(jìn)一步說明8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練引發(fā)大鼠過度訓(xùn)練的同時(shí)導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)、功能受損。Nrf2是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)中樞，受kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)調(diào)控，通過與ARE相互作用，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20-21]。HO-1作為Nrf2下游靶標(biāo)，廣泛參與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答過程[22]。作為重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白，其比值變化決定細(xì)胞凋亡發(fā)生的走向[23-24]。本研究中，與C組相比，OM組大鼠腎臟Nrf2表達(dá)水平無明顯變化，但HO-1表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)腎臟T-AOC和SOD活性顯著降低，MDA濃度顯著升高。說明過度訓(xùn)練使氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，Nrf2轉(zhuǎn)錄活性降低，造成其下游抗氧化蛋白HO-1表達(dá)下降，機(jī)體抗氧化能力也隨之降低，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。同時(shí)，與C組相比，OM組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡水平明顯上升，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值顯著降低。進(jìn)一步說明，長時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)過度訓(xùn)練所致運(yùn)動(dòng)性腎損傷中，機(jī)體氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)，抗氧化能力下降，腎臟細(xì)胞凋亡加劇，是運(yùn)動(dòng)性腎臟損傷發(fā)生與發(fā)展的主要因素。

姜黃素是我國最早被允許使用的天然色素之一，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，姜黃素的功效主要為抗癌、抗炎、預(yù)防老年癡呆。本研究旨在探討姜黃素是否可以通過延緩過度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激，有效抑制大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與OM組相比，COM組大鼠血清T/Cor比值升高，T-AOC和SOD活性增強(qiáng)，MDA濃度下降，Cr和BUN濃度降低，腎臟組織形態(tài)明顯改善，說明補(bǔ)充姜黃素可有效緩解過度訓(xùn)練引發(fā)的運(yùn)動(dòng)性腎損傷。研究表明，進(jìn)行5/6腎切除術(shù)后大鼠腎臟Nrf2和HO-1表達(dá)下降，Keap1表達(dá)增加，而姜黃素可以通過調(diào)節(jié)Nrf2-Keap1途徑，誘導(dǎo)抗氧化酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，有效緩解上述氧化應(yīng)激過程[25-26]。此外，通過上調(diào)Nrf2 / HO-1表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用，姜黃素也可改善慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷[27]。同時(shí)，與OM組相比，COM組大鼠腎臟Nrf2和HO-1表達(dá)水平、Bcl-2/Bax比值均顯著升高。Niture等[5]的研究證明，Nrf2可以通過與Bcl-2基因抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，調(diào)控Bcl-2表達(dá)和細(xì)胞凋亡過程。Zhang等[28]的研究中，通過使用Nrf2抑制劑，發(fā)現(xiàn)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系中Bcl-2表達(dá)減少，Bcl-2/Bax比值降低。上述研究表明，Nrf2表達(dá)水平的變化，可以直接影響細(xì)胞凋亡過程。姜黃素具有酚羥基和β-二酮2個(gè)活性部位，均可以提供質(zhì)子，直接參與阻斷自由基的反應(yīng)[29]。同時(shí)，作為一種雙功能抗氧化劑，姜黃素也可以通過誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)，以間接方式發(fā)揮其抗氧化活性。姜黃素中的酚羰基可以與Keap1中半胱氨酸殘基上的巰基發(fā)生加成反應(yīng)，使Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，從而促進(jìn)Nrf2 的核轉(zhuǎn)位[30]，通過增強(qiáng)Nrf2與ARE的結(jié)合，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加[31]，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡過程。

綜上所述，結(jié)合病理特征、損傷指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)和凋亡指標(biāo)的變化，說明補(bǔ)充姜黃素可以通過上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，增強(qiáng)腎臟抗氧化能力，有效緩解過度訓(xùn)練引發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而增加Bcl-2表達(dá)，減少Bax表達(dá)，抑制大鼠腎臟細(xì)胞凋亡，維持腎臟組織結(jié)構(gòu)完整和功能正常，這對防治過度訓(xùn)練導(dǎo)致腎臟組織損傷具有重要的理論和實(shí)際意義。