硫化氫對(duì)糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響及其機(jī)制*

賈 強(qiáng)， 王 蕾， 王其一， 劉小粉， 馬善峰， 楊 銳

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 安徽 蚌埠 233030)

糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，其由糖尿病微血管病變引起，最終導(dǎo)致慢性腎功能衰竭[1]。腎臟纖維化是糖尿病腎病重要的病理改變之一。腎臟纖維化的特征主要表現(xiàn)在肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、聚集，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分如膠原蛋白和纖維連接蛋白等過(guò)度積聚[2, 3]。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad3信號(hào)通路在腎臟纖維化中起重要作用[4]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子[5]。內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)；CSE則主要存在于心血管系統(tǒng)，且容易被炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PAG)阻斷[6]。大量研究表明，H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和視覺(jué)系統(tǒng)等均發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)功能[7-9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)CSE/H2S與腎臟纖維化密切相關(guān)[10]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)建立1型糖尿病大鼠腎損傷模型，分別給予H2S的外源性供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)和CSE的阻斷劑PAG干預(yù)，觀察H2S對(duì)糖尿病大鼠腎臟纖維化的影響并探討其分子作用機(jī)制，旨在為H2S在臨床上治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠(32只)由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(180±20) g。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、NaHS和PAG購(gòu)自Sigma公司；血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清肌酐(serum creatinine，SCr)和羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6 (interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技公司；兔抗大鼠Smad3和磷酸化Smad3(phosphorylated-Smad3，p-Smad3)一抗抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗大鼠IV型膠原(collagen-IV，col-IV)一抗抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(NC)組、糖尿病對(duì)照(DC)組、糖尿病+NaHS(DM+NaHS)組和糖尿病+PAG(DM+PAG)組(n=8)。大鼠禁食12 h后，NC組腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，其余3組大鼠均一次性腹腔注射55 mg/kg STZ。3 d后，大鼠禁食后測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，取FBG≥16.7 mmol/L為1型糖尿病大鼠。造模成功后，所有大鼠自由飲食、飲水。第5周起，NC組和DC組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，DM+NaHS組和DM+PAG組大鼠分別腹腔注射56 μmol/kg NaHS和40 mg/kg PAG[6]，每天1次，共干預(yù)4周。

1.3 檢測(cè)FBG、BUN和SCr水平

第8周末，大鼠腹腔注射4%水合氯醛(10 ml/kg)誘導(dǎo)麻醉，測(cè)FBG值。腹主動(dòng)脈采血取血清，利用試劑盒檢測(cè)血清中BUN和SCr水平。

1.4 Masson染色觀察腎膠原纖維沉積

取大鼠新鮮腎臟，浸于10%福爾馬林中固定，脫水、包埋、切片，Masson染色后觀察膠原纖維變化。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF=膠原面積/總面積，取平均值。

1.5 電鏡觀察腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)變化

取大鼠新鮮腎組織，切割成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，浸入4℃、2.5%戊二醛溶液中固定，脫水包埋、制備超薄切片。經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，透射電鏡觀察腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)變化。

1.6 腎組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平檢測(cè)

取大鼠腎臟，冰上制備組織勻漿，分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平。

1.7 Western blot檢測(cè)腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白水平

提大鼠腎臟組織蛋白，測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。室溫封閉2 h，再分別加入1∶1 000稀釋的TGF-β1、Smad3和p-Smad3一抗抗體，1∶300稀釋的col-IV一抗抗體，1∶2 000稀釋的GAPDH一抗抗體，4℃過(guò)夜孵育；TBST緩沖液洗膜后，加入1∶2 000稀釋的二抗抗體，室溫孵育1 h；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影，曝光成像后測(cè)定條帶的灰度值，計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組FBG、BUN和SCr水平的變化

與NC組比較，DC組大鼠的FBG、BUN和SCr值顯著增大(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組和DM+PAG組FBG均無(wú)顯著性差異，DM+NaHS組大鼠的BUN和SCr值顯著減小(P<0.01)；DM+PAG組BUN和SCr值較DC組進(jìn)一步增加(P< 0.01，表1)。

GroupFBG (mmol/L)BUN (mmol/L)SCr (μmol/L)NC5.75±0.867.15±0.7226.34±2.57DC24.96±3.62??14.85±1.60??43.60±3.24??DM+NaHS22.48±3.4511.69±1.23##35.28±3.01##DM+PAG25.83±3.7117.10±1.74##48.52±2.76##

FBG: Fasting blood glucose; BUN: Blood urea nitrogen; SCr: Serum creatinine

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.2 各組腎臟膠原纖維和CVF的變化

Masson染色結(jié)果(圖1)顯示：NC組大鼠腎小球和腎小管正常，膠原沉積較少；DC組腎小球和腎小管膠原沉積明顯增多。與DC組相比，DM+NaHS組腎小球和腎小管膠原纖維沉積明顯減少；DM+PAG組膠原纖維沉積明顯增加。

膠原纖維分析結(jié)果顯示，與NC組相比，DC組膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)從9.56±1.45上升至23.31±3.18(P<0.01)。與DC組相比，DM+NaHS組CVF下降至16.20±2.59(P<0.01)；DM+PAG組CVF上升為27.43±3.62(P<0.01)。

Fig.1The deposition of collagen fibers in rat renal tissues (Masson staining ×400)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.3 各組腎皮質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的變化

透射電鏡結(jié)果顯示，NC組中腎小球基底膜厚度均一，足細(xì)胞的足突形狀正常、排列整齊。DC組腎皮質(zhì)基底膜明顯增厚，系膜基質(zhì)增多，多個(gè)足突融合。DM+NaHS組腎小球基底膜厚度明顯改善，系膜基質(zhì)增生減少，足突融合程度較DC組明顯減輕。DM+PAG組較DC組損傷進(jìn)一步加重，基底膜增厚顯著、系膜基質(zhì)增多，足突融合(圖2)。

Fig.2Changes of ultrastructure in the different groups(×20 000)

A: Normal control group(NC); B: Diabetic control group(DC); C: Diabetes mellitus(DM)+ Sodium hydrosulfide(NaHS)group; D: DM+DL-propargylglycine(PAG)group

2.4 各組腎臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平的變化

與NC組比較，DC組腎臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平顯著增高(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平明顯降低(P<0.01)；DM+PAG組IL-1β、IL-6、TNF-α和Hyp水平較DC組進(jìn)一步增高(P<0.01，表2)。

GroupIL-1β (pg/mg)IL-6 (pg/mg)TNF-α (pg/mg)Hyp (μg/mg)NC29.73±3.4549.25±4.83109.24±11.783.09±0.44DC60.58±5.21??87.32±6.84??201.69±20.15??6.07±0.72??DM+NaHS47.26±4.67##73.81±6.37##163.52±18.76##4.85±0.68##DM+PAG68.30±5.09##96.63±6.92##227.55±21.60##7.16±0.75##

IL-1β: Interleukin-1β; IL-6: Interleukin-6; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; Hyp: Hydroxyproline

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

2.5 各組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3和col-IV蛋白表達(dá)水平的變化

與NC組比較，DC組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平顯著增高(P<0.01)。與DC組比較，DM+NaHS組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平顯著降低(P<0.01)；DM+PAG組腎臟組織TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p-Smad3/Smad3和col-IV水平較DC組進(jìn)一步增高(P<0.01，表3，圖3)。

Tab.3 Protein expression levels of TGF-β1, Smad3, p-Smad3 and col-IV in rat renal tissues n=8)

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

**P<0.01vsNC group;##P<0.01vsDC group

Fig.3The expressions of TGF-β1, Smad3, p-Smad3, col-IV and GAPDH in rat renal tissues tested by Western blot

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; col-IV: Collagen-IV; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3 討論

糖尿病是由于機(jī)體胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，出現(xiàn)以持續(xù)高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征。糖尿病腎病是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭和終末期腎病的主要原因。糖尿病腎病的主要病理改變是炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球系膜基質(zhì)增加，基底膜增厚和間質(zhì)纖維化[11]。腎臟纖維化是以ECM如col-IV過(guò)度積累、異常沉積為特征，最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎功能衰竭[12]。Masson染色是常用的檢測(cè)膠原纖維沉積的方法。此外，Hyp是合成col-IV的主要原料。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組大鼠比較，DC組大鼠的FBG、BUN和SCr水平顯著增加，腎超微結(jié)構(gòu)損傷明顯加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達(dá)顯著增加，表明糖尿病會(huì)引發(fā)腎臟損傷及腎組織纖維化。

H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，參與體內(nèi)多個(gè)組織系統(tǒng)的生理功能調(diào)控[13]。最近的研究表明，外源性H2S具有減輕糖尿病腎臟纖維化的作用[14]，但是其具體機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，給予外源性H2S的供體NaHS治療后，雖然H2S對(duì)FBG的影響較小，但DM+NaHS組大鼠BUN和SCr水平較DC組明顯降低，腎超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達(dá)明顯降低；而給予CSE的阻斷劑PAG干預(yù)后，DM+PAG組大鼠BUN和SCr水平增高，腎超微結(jié)構(gòu)損傷加重，CVF、Hyp含量和col-IV蛋白表達(dá)較DC組均進(jìn)一步提高，提示H2S在調(diào)節(jié)糖尿病大鼠腎臟損傷和纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，且外源性H2S可明顯減輕糖尿病腎臟纖維化。

TGF-β1是腎臟中所有類型的細(xì)胞均能夠合成的一種促纖維化介質(zhì)。在纖維化疾病中，促炎因子TNF-α可誘導(dǎo)TGF-β1表達(dá)上調(diào)[15]。在糖尿病大鼠腎臟中，TGF-β1表達(dá)明顯增高[16]。TGF-β1還可激活ECM基因的轉(zhuǎn)錄、抑制ECM降解，并誘導(dǎo)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化[17, 18]。Smads家族是TGF-β1作用的關(guān)鍵性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。其中，Smad3可被TGF-β1磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路是引起多種器官組織如肝、心、肺等纖維化的中心路徑[20-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，DC組中促炎因子如IL-1β、IL-6和TNF-α釋放明顯增多，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3的表達(dá)水平均顯著增加，這表明TGF-β1/Smad3通路在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎纖維化過(guò)程中高度活化。NaHS處理后，DM+NaHS組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α釋放明顯降低，TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表達(dá)水平明顯下調(diào)；而DM+PAG組中，IL-1β、IL-6和TNF-α釋放以及TGF-β1、Smad3、p-Smad3和p-Smad3/Smad3表達(dá)水平較DC組均進(jìn)一步增高，提示H2S可通過(guò)減少促炎因子釋放，下調(diào)TGF-β1/Smad3通路減輕糖尿病大鼠腎臟纖維化。

綜上所述，H2S對(duì)糖尿病大鼠的腎臟纖維化具有重要的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)減少促炎因子釋放，下調(diào)TGF-β1/Smad3通路，進(jìn)而抑制腎臟col-IV的過(guò)量生成，而減輕糖尿病腎纖維化。