SB-271046對匹羅卡品致癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

黃明珠， 黃華品， 林婉揮， 陳圣根

癲癇患者合并認知功能障礙越來越得到人們的關(guān)注，不論是在臨床研究還是動物模型研究中都有大量的報道[1，2]。目前研究表明5-HT與癲癇關(guān)系密切，其可能通過受體起作用。大量的研究表明5-HT6R拮抗劑可以改善認知功能[3，4]，有些5-HT6R拮抗劑已經(jīng)作為治療阿爾茨海默病AD的藥物[5]。然而這些相關(guān)研究大部分都是在癡呆模型上進行的，在癲癇模型上的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)研究目前國內(nèi)外較少報道。因此我們通過建立氯化鋰-匹羅卡品慢性癲癇模型，然后側(cè)腦室注射5-HT6R拮抗劑SB-271046(10 μg，20 μg)，最后予Y迷宮、Morris水迷宮來檢測SB-271046對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為臨床上癲癇患者的學(xué)習(xí)記憶障礙的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥品及實驗儀器 氯化鋰(Sigma公司)，匹羅卡品 (Sigma公司)，10%羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrine，HP β CD)(溶解SB-271046用，Sigma公司)，SB-271046(Tocris 公司)，腦立體定位儀(Stoelting公司)，Y迷宮、Morris 水迷宮系統(tǒng)(Smart-ma-ss，西班牙Panlab公司)。

1.2 實驗動物分組 清潔級雄性SD成年大鼠，由中科院斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)：2007-0005。大鼠體重200～250 g，10～13 w齡，12 h光照，12 h黑暗，自由攝取水和食物。動物房溫度保持在22～26 ℃。實驗動物按照隨機法首先分為2組：空白對照組(Vehicle)10只，匹羅卡品組(PILO)40只；然后根據(jù)腹腔注射PILO后是否出現(xiàn)Ⅳ級及Ⅳ級以上發(fā)作(Racine分級)，未達到者予以剔除，達到者納入實驗；4 w后再將存活的PILO組按照隨機數(shù)字表分為：模型組(HP-CD)即側(cè)腦室注射HP-β-CD4 μl組；10 μg-SB組即側(cè)腦室注射SB-271047劑量為10 μg，4 μl；20 μg-SB組即側(cè)腦室注射SB-271046劑量為20 μg，4 μl。

1.3 LiCl-PILO癲癇動物模型建立 于腹腔注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg，16～18 h后腹腔注射PILO 30 mg/kg，在給藥PILO前30 min，腹腔注射阿托品1 mg/kg，以緩解PILO的外周膽堿能效應(yīng)。連續(xù)觀察30 min，根據(jù)Racine分級，發(fā)作級數(shù)達到Ⅳ級及Ⅳ級以上并持續(xù)30 min以上的即造模成功。不成功者按照原劑量每30 min追加1次，追加3次仍不成功者，剔除。造模成功的大鼠60 min后，予以地西泮10 mg/kg解痙，解痙效果不佳者按原劑量每60 min追加一次。存活大鼠腹腔注射平衡葡萄糖鹽水5 ml/只，2次/d，連續(xù)3 d，同時予以流質(zhì)飲食。

1.4 側(cè)腦室注射5-HT6R拮抗劑SB-271046 大鼠造模成功后4 w，予10%水合氯醛深度麻醉，在腦立體定位儀幫助下，按照 Watson《大鼠腦立體定位圖譜》，側(cè)腦室(前囟后0.8 mm，旁開1.5 mm，深度4 mm)注射藥物。HP-CD組注入10% HP-β-CD 4 μl；10 μg-SB組注入SB-271046，2.5 μg/ μl，4 μl；20 μg-SB組注入SB-271046，5 μg/μl，4 μl[6]。注射時間維持4 min，速度1 μl/min。手術(shù)后恢復(fù)1 w。

1.5 Y迷宮、Morris水迷宮測評 造模成功后6 w進行Y迷宮、Morris水迷宮實驗，檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶。

Y迷宮裝置是由3個等長的黑色臂和一個中間區(qū)域組成，各臂互成120°。臂長50 cm，寬10 cm，高20 cm，支架高50 cm。動物放入后，采用SMART-ma-ss軟件采集圖像和分析數(shù)據(jù)。Y迷宮為時2 d，方法學(xué)按Robert[7]，Dellu等[8]的描述。1 d為自主交替實驗，每只大鼠從同一個臂即起始臂放入，連續(xù)自主交替8 min，檢測自主交替自主交替率。每只大鼠結(jié)束后放回籠子，在進行下一只實驗時，用75%的酒精消除Y迷宮臂內(nèi)的氣味。交替率%=交替次數(shù)/(總次數(shù)-2)%。 2 d為新奇事物探索實驗，采用4 h間隔，先隨機封閉一個臂，讓大鼠在剩余的兩個臂中自由探索10 min，4 h后打開擋板，每只大鼠自由探索5 min，記錄大鼠進入各臂的次數(shù)和時間，尤其是新臂的次數(shù)和時間。每只大鼠結(jié)束后放回籠子，進行下一只前同樣用75%酒精消除氣味影響。

Y迷宮實驗結(jié)束后2 d進行Morris水迷宮實驗。水迷宮方法學(xué)按照Charles等[9]描述的方法。實驗總共歷行6 d。1～5 d為定位航行實驗，每只大鼠每天進行4個象限，記錄在120 s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期)、速度、路程等；6 d撤離平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)在目標象限(原平臺所在象限)停留的時間、穿越平臺(原平臺所在位置)次數(shù)等。

2 結(jié) 果

2.1 實驗大鼠存活 Vehicle組10只大鼠全部存活。造模組40只大鼠，注射PILO后成功出現(xiàn)Ⅳ級及Ⅳ級以上并持續(xù)30 min的有34只，6只再追加3次后仍失敗，剔除。成功率為85%。由于急性期大鼠易死亡，但2 w后大鼠基本穩(wěn)定，死亡率大大下降，故在2 w后統(tǒng)計成功SE的大鼠，存活24只，死亡10只，死亡率29.4%。4 w后進行側(cè)腦室給藥，至6 w后行為學(xué)實驗時，HP-CD組、10 μg-SB組和20 μg-SB組各死亡2只。故最后行為學(xué)的大鼠共28只，Vehicle組10只，HP-CD組6只，10 μg-SB組6只，20 μg-SB組6只。

2.2 Y迷宮測評

2.2.1 Y迷宮自主交替行為實驗，檢測在8 min內(nèi)各組大鼠的自發(fā)性交替率。

在Y迷宮SAB中，4組的自主交替率有差別(P<0.001，ANOVA，F(xiàn)(3，27)=12.048，P=0.000，見圖1及表1)；與Vehicle相比，P(HP-CD)=0.000，P(10 μg-SB)=0.004；與HP-CD相比，P(20 μg-SB)=0.018；余兩兩比較，按照α=0.05水平，均未達統(tǒng)計學(xué)意義?？梢?，HP-CD組其自主交替率明顯下降(P<0.001)，藥物組自主替率提高尤其是20 μg劑量(P<0.05)，提示可能具有劑量依賴性。

2.2.2 Y迷宮新奇事物探索實驗，檢測各組大鼠在各臂的時間，尤其是新臂的時間。

在Y迷宮NOD中，各組內(nèi)3個臂時間比有差別。在Vehicle組，3個臂時間比有差別(P<0.01，ANOVA，F(xiàn)(2，29)=5.835，P=0.008，見圖2)；與新臂相比，有差別P(Start)=0.015，余兩兩比較無差別(P>0.05)。在HP-CD組，3個臂時間比也有差別(P<0.01，ANOVA，F(xiàn)(2，17)=7.116，P=0.007，見圖2及表1)，與新臂相比，有差別P(Open)=0.006，余兩兩比較無差別(P>0.05)。藥物組各臂時間比差別不明顯(P>0.05，ANOVA，F(xiàn)10 μg-SB(2，17)=0.21，P10 μg-SB=0.813；F20 μg-SB(2，17)=0.378，P20 μg-SB=0.691。見圖2)。各組新臂時間比有差別(P<0.05，ANOVA，F(xiàn)New(3，27)=3.595，PNew=0.028，見圖2)；與Vehicle組相比，HP-CD組其新臂時間比顯著下降(P<0.01，P(HP-CD)=0.019，余兩兩比較均無差別(P>0.05)。大鼠各臂的時間比和隨機概率33.33%比較，采用t檢驗。各組新臂和33.33%比較，結(jié)果如下：t(Vehicle，9)=2.086，P(Vehicle)=0.067；t(HP-CD，5)=-3.069，P(HP-CD)=0.028，t(10 μg-SB，5)=-0.117，P(10 μg-SB)=0.912；t(20 μg-SB，5)=1.175，P(20 μg-SB)=0.293?？梢?，各組組內(nèi)的新臂時間比較，Vehicle組其新臂時間明顯延長，而HP-CD組新臂時間明顯縮短，而且明顯低于33.33%的隨機概率(P<0.05)，盡管藥物組未達統(tǒng)計學(xué)意義，但20 μg組其新臂時間是延長的，而且高于隨機概率，各組間新臂時間比較，HP-CD也是明顯下降的，而藥物組提高未達統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 Morris水迷宮測評

2.3.1 Morris水迷宮定位航行實驗中，連續(xù)進行5 d，測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的獲取階段的學(xué)習(xí)能力，主要測定大鼠找到隱蔽平臺的潛伏期。

在1 d的實驗中，各組的平均潛伏期有差別(P<0.001，ANOVA，F(xiàn)(3，15)=15.478，P=0.000，見圖3)。與Vehicle相比，P(HP-CD)=0.001，P(10 μg-SB)=0.000；與HP-CD相比，P(20 μg-SB)=0.032；與10 μg-SB組相比，P=0.011，余兩兩比較無差別(P>0.05)?？梢?，HP-CD，10 μg-SB其平均潛伏期較正常組明顯延長，與HP-CD相比，藥物組平均潛伏期明顯縮短，尤其是20 μg-SB組，而且兩個藥物組比較，有差別(P<0.05)，提示可能具有劑量依賴性。

圖2 SB-271046對大鼠Y迷宮新奇事物探索實驗的影響(各組新臂 vs 起始臂及開放臂：*P<0.05，**P<0.01；模型組新臂 vs 空白組新臂：#P<0.01)

圖3 SB-271046 對大鼠在水迷宮定位航行實驗1 d到達平臺潛伏期的影響(空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組比較：***P<0.001；20 μg藥物組 vs 模型組及10 μg藥物組，﹟P<0.05)

4組5 d的平均潛伏期也是有差別的(P<0.01，Welch，F(xiàn)(3，8.576)=11.896，P=0.002，見圖4)；與Vehicle組相比，P(HP-CD)=0.004，P(10 μg-SB)=0.025；與HP-CD組相比，P(20 μg-SB)=0.036；余兩兩比較無差別(P>0.05)?？梢?，HP-CD組和10 μg-SB組平均潛伏期較正常組明顯延長，而尤其是前者(P<0.01)；同時與HP-CD相比，藥物組則明顯縮短，尤其是20 μg-SB(P<0.05)。

2.3.2 Morris水迷宮探索性試驗，檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶的維持階段的再現(xiàn)能力。

圖4 SB-271046對大鼠在水迷宮總5 d定位航行實驗到達平臺潛伏期的影響(空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：*P<0.05，**為P<0.01；模型組 vs 20 μg藥物組：#P<0.05)

圖5 SB-271046對大鼠在水迷宮空間探索實驗到達平臺潛伏期的影響(空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：**P<0.01)

圖6 SB-271046對大鼠在水迷宮空間探索實驗穿越平臺次數(shù)的影響(空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：*P<0.05)

圖7 SB-271046對大鼠在水迷宮空間探索實驗靶象限停留時間比的影響 (空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：*P<0.05)

表1 SB-271046對大鼠Y迷宮自主交替率及新奇事物探索行為的影響

空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；模型組 vs 20 μg藥物組、空白組：#P<0.05

表2 SB-271046對大鼠水迷宮探索實驗的影響

空白組 vs 模型組、10 μg藥物組、20 μg藥物組：*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

臨床上癲癇患者的記憶損害的類型多樣，如言語性記憶，片段性記憶，空間記憶等；同樣，在PILO癲癇動物模型上也有類似發(fā)現(xiàn)[2]。研究表明Y迷宮自主交替實驗可以檢測動物空間工作記憶，Y迷宮新奇事物探索的場地再認實驗可檢測片段式記憶[3]，水迷宮實驗可檢測空間參照記憶和空間工作記憶。因此本實驗建立LiCl-PILO癲癇模型，采用Y迷宮和水迷宮來研究癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶是合理的。在連續(xù)8 min的Y迷宮SAB中，HP-CD組其自主交替率顯著下降，提示其學(xué)習(xí)記憶能力的嚴重受損，可見癲癇大鼠其學(xué)習(xí)能力下降，這與臨床上癲癇患者空間學(xué)習(xí)記憶和短時記憶受損表現(xiàn)[10]是一致的；藥物組提高，尤其是20 μg劑量，提示藥物具有改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。在Y迷宮新奇事物探索4 h間隔的實驗中，在 Vehicle組其新臂時間明顯延長，而且大于隨機概率33.33%，提示其學(xué)習(xí)提取再現(xiàn)能力是正常的；而HP-CD組卻明顯縮短，并且與隨機交替率33.33%相比，明顯下降(P<0.05)，表現(xiàn)出不能識別新臂，提示其學(xué)習(xí)記憶的提取再現(xiàn)能力嚴重受損。4組的新臂時間比較，發(fā)現(xiàn)HP-CD組明顯下降為26.15%，可見癲癇大鼠空間記憶能力受損，尤其是記憶提取再現(xiàn)過程受損；而藥物組新臂時間是延長的，盡管未達統(tǒng)計學(xué)意義，這可能提示5-HT6受體拮抗主要作用于記憶的獲得階段而非提取再現(xiàn)階段。這與Costa等[3]的結(jié)果一致。他們發(fā)現(xiàn)5-HT6R拮抗劑可以改善年輕成年鼠的記憶獲得鞏固階段，并可逆轉(zhuǎn)老年鼠因年老而造成的記憶鞏固能力的缺陷。

在Morris水迷宮定位航行實驗中，大鼠在每天4次的實驗中，幾乎都是第1次的潛伏期最長，而后逐漸縮短，而且隨著天數(shù)增加，每天的平均潛伏期也是不斷縮短的，尤其是Vehicle組和20 μg-SB組，其5 d的平均潛伏期明顯縮短(P<0.05)。這就提示了Vehicle組和藥物20 μg組的大鼠其學(xué)習(xí)記憶能力是良好的，能形成對平臺位置的長期記憶并能提取儲存的空間記憶。HP-CD組的大鼠在2 d～5 d的試驗中，其每天4次的試驗的潛伏期無明顯的變化，并且5 d平均潛伏期改變未達統(tǒng)計學(xué)意義，這就提示了HP-CD組大鼠對平臺位置不能形成長期記憶或者提取存儲的空間記憶受損。10 μg-SB組 5 d的平均潛伏期也是逐漸縮短的，盡管未達統(tǒng)計學(xué)意義，提示其改善作用不明顯。總體上，HP-CD 5 d的平均潛伏相對正常組是延長的，而藥物組可以改善其表現(xiàn)，尤其是20 μg劑量組(P<0.05)，提示可能存在劑量依賴性。這與Foley等[11]的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)SB-271046可以改善大鼠在Morris水迷宮的表現(xiàn)，可改善空間記憶的獲得階段。Morris水迷宮6 d的空間探索實驗中，HP-CD組其潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，在原平臺象限停留時間明顯減少，表明了其學(xué)習(xí)記憶提取再現(xiàn)能力的受損，與Inostroza等[2]的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)LiCl-PILO癲癇模型的大鼠在空間學(xué)習(xí)記憶的獲得和維持能力明顯受損。藥物組盡管還尚達到統(tǒng)計學(xué)意義，但具有明顯改善的趨勢，提示藥物在記憶提取再現(xiàn)階段的作用不強，與King等[12]結(jié)果大體一致。他們發(fā)現(xiàn)不論急性還是慢性給藥R0-046790還是SB-271046(10 mg/kg)均能改善大鼠的記憶鞏固存儲階段，而不作用于記憶編碼和提取過程。

5-HT6R拮抗劑改善學(xué)習(xí)記憶的機制還尚不明確。Mitchell等[13]采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，發(fā)現(xiàn)5-HT6R在紋狀體過度表達會損害記憶；Marcos等[14]在大鼠水迷宮實驗，發(fā)現(xiàn)給藥SB-271046組的5-HT6R的表達及其mRNA表達均下降；因此推測5-HT6R過表達損害記憶，而5-HT6R拮抗劑可抑制5-HT6R受體的活性，從而改善記憶，并且他們認為5-HT6受體拮抗劑介導(dǎo)的認知增強效應(yīng)是通過磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(pERK1/2)。而且磷酸化的p-ERK1/2通過活化轉(zhuǎn)錄因子c-fos在突觸重組中發(fā)揮重要作用[15]。王亮等[16]發(fā)現(xiàn)5-HT6R受體在人及匹羅卡品癲癇模型小鼠的表達上調(diào)，5-HT6R受體拮抗劑可以抑制癲癇發(fā)作及mTOR的活性，在改善癲癇發(fā)作及阻斷HTR6/mTOR信號通路具有重要作用。我們課題組林婉揮等[17]發(fā)現(xiàn)5-HT6受體通過激活p-ERK1/2及Fyn信號通路從而影響苔蘚纖維出芽的形成，而成進一步調(diào)節(jié)GAP-43的表達，發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶等作用。

綜上，我們的實驗結(jié)論是5-HT6R拮抗劑SB-27046可以改善癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，尤其是作用于記憶獲得鞏固階段，可能具有一定的劑量依賴性，其改善學(xué)習(xí)記憶的作用機制目前國內(nèi)外包括我們課題組正在進行研究，如我們正在進一步深入研究5-HTR6受體介導(dǎo)mTOR通路在慢性顳葉癲癇模型的學(xué)習(xí)記憶等相關(guān)方面的分子學(xué)機制，為臨床上癲癇合并認知功能障礙的患者的治療提供新思路。

[1]趙 爽，張勝昌. 癲癇伴記憶認知損傷與突觸可塑性的關(guān)系[J]. 中國老年學(xué)，2017，37(15)：3885-3887.

[2]Inostroza M，Cid E，Brotons-Mas J，et al. Hippocampal-dependent spatial memory in the water maze is preserved in an experimental model of temporal lobe epilepsy in rats[J]. Plos One，2011，6(7)：e22372.

[3]Costa VDS，Duchatelle P，Boulouard M，et al. Selective 5-HT6 receptor blockade improves spatial recognition memory and reverses age-related deficits in spatial recognition memory in the mouse[J]. Neuropsychopharmacology：Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology，2009，34(2)：488-500.

[4]Amat-Foraster M，Leiser SC，Herrik KF，et al. The 5-HT6 receptor antagonist idalopirdine potentiates the effects of donepezil on gamma oscillations in the frontal cortex of anesthetized and awake rats without affecting sleep-wake architecture[J]. Neuropharmacology，2016，113(Pt A)：45-59.

[5]Calhoun A，Ko J，Grossberg GT. Emerging chemical therapies targeting 5-hydroxytryptamine in the treatment of Alzheimer’s disease[J]. Expert Opin Emerg Drugs，2017，22(1)：101-105.

[6]Loiseau F，Dekeyne A，Millan MJ. Pro-cognitive effects of 5-HT6 receptor antagonists in the social recognition procedure in rats：implication of the frontal cortex[J]. Psychopharmacology，2008，196(1)：93-104.

[7]Hughes RN. The value of spontaneous alternation behavior (SAB) as a test of retention in pharmacological investigations of memory[J]. Neurosci Biobehav Rev，2004，28(5)：497-505.

[8]Dellu F，Contarino A，Simon H，et al. Genetic differences in response to novelty and spatial memory using a two-trial recognition task in mice[J]. Neurobiol Learn Mem，2000，73(1)：31-48.

[9]Vorhees CV，Williams MT. Morris water maze：procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory[J]. Nat Protoc，2006，1(2)：848-858.

[10]Cánovas R，León I，Serrano P，et al. Spatial navigation impairment in patients with refractory temporal lobe epilepsy：evidence from a new virtual reality-based task[J]. Epilepsy Behav，2011，22(2)：364-369.

[11]Foley AG，Murphy KJ，Hirst WD，et al. The 5-HT(6) receptor antagonist SB-271046 reverses scopolamine-disrupted consolidation of a passive avoidance task and ameliorates spatial task deficits in aged rats[J]. Neuropsychopharmacology：Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology，2004，29(1)：93-100.

[12]King MV，Sleight AJ，Woolley ML，et al. 5-HT 6，receptor antagonists reverse delay-dependent deficits in novel object discrimination by enhancing consolidation-an effect sensitive to NMDA receptor antagonism[J]. Neuropharmacology，2004，47(2)：195-204.

[13]Mitchell ES，Sexton T，Neumaier JF. Increased Expression of 5-HT6 Receptors in the Rat Dorsomedial Striatum Impairs Instrumental Learning[J]. Neuropsychopharmacology，2007，32(7)：1520-1530.

[14]Marcos B，Cabero M，Solas M，et al. Signalling pathways associated with 5-HT6 receptors：relevance for cognitive effects[J]. Int J Neuropsychopharmacol，2010，13(6)：775-784.

[15]Xu ZC，Chen YM，Xu P，et al. Epileptiform discharge upregulates p-ERK1/2，growth-associated protein 43 and synaptophysin in cultured rat hippocampal neurons[J]. Seizure，2009，18(10)：680-685.

[16]Wang L，Lv Y，Wang X，et al. 5-HT6 receptors recruitment of mTOR modulates sezure activity in epilesy[J]. Mol Neuobiol，2015，51(3)：1292-1299.

[17]Lin W，Huang W，Huang H，et al. The role of 5-HT6R in mossy fiber sprouting：activating Fyn and p-ERK1/2 in pilocarpin-induced chronic epileptic rats[J]. Cell Physiol Biochem，2017，42(1)：231-241.