一株APMV-4毒株的分離鑒定及其PCR檢測(cè)方法的建立*

楊金興，袁小遠(yuǎn)，孟凱，李莉，王友令

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023）

副黏病毒科腮腺炎病毒屬的APMVs分為9個(gè)血清型(APMV 1～9)。在所有血清型當(dāng)中，最為熟悉的是新城疫病毒，它是禽副黏病毒1型的代表毒株；但是針對(duì)APMV 2～9的研究非常少[1,2]。APMV-4的基因組全長(zhǎng)是15054個(gè)核苷酸，并與副黏病毒的“六規(guī)則”一致。和NDV相同，APMV-4基因組也包含6個(gè)非重疊的基因：NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）、M（膜蛋白）、F（融合蛋白）、HN（血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白）和L（RNA依賴性聚合酶）。本研究對(duì)分離鑒定的APMV-4型毒株進(jìn)行PCR檢測(cè)，建立的檢測(cè)方法可有效地區(qū)分APMV-1型和APMV-4型毒株，為APMV-4的研究提供重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及其背景資料、試驗(yàn)動(dòng)物 APMV-1所用毒株為NDV的GM強(qiáng)毒株、APMV-4 QY毒株均由山東省SPF雞研究中心分離鑒定保存。NDV抗原和血清、SPF雞胚均來(lái)自山東省SPF雞研究中心。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自百泰克生物公司、One step RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 毒株分離鑒定 病鴨的組織 （氣管、肝臟等）按1：2體積加入滅菌生理鹽水，研磨、無(wú)菌處理、離心后取上清，按0.1ml/枚的接種量接種9日齡SPF雞胚3個(gè)，棄去24h內(nèi)的死胚，每6h照蛋一次。收集尿囊液，按常規(guī)方法進(jìn)行血凝和血凝交叉抑制試驗(yàn)。

1.2.2 PCR方法的建立

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中APMV-4的全基因組序列 （No：KC439346）設(shè)計(jì) 1對(duì)引物APMV4-F/R。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級(jí)別純化。

APMV4-F：5′-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3′

APMV4-R：5′-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3′。預(yù)計(jì)擴(kuò)增約800bp。

1.2.2.2 RNA提取 取GM和QY毒株各200μl的尿囊液來(lái)提取病毒RNA，提取過(guò)程按照百泰克生物公司的RNA提取操作進(jìn)行，最后用25μl DEPC水來(lái)溶解RNA，提取后立即進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR。

1.2.2.3 一步法RT-PCR檢測(cè)和敏感性試驗(yàn)

50μl的 RT-PCR 體系如下：RNA 模板 10μl、2×PCR Buffer（含 dNTP） 25μl、混合酶（RTase、HS-taq、RNase inhibitor）2μl、Primer-F/R (20μm) 各1μl、RNase-free H2O 補(bǔ)充至 50μl，設(shè) NDV GM 的RNA和水作為對(duì)照。RT-PCR反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化確定為：RT 42min 30℃，94℃ 3min；隨后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 94℃ 20s、50℃ 30s、72℃ 30s 進(jìn)行 35 個(gè) 循環(huán)，最后72℃延伸4min。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察條帶。將分離毒株原液進(jìn)行10倍的倍比稀釋?zhuān)S后同樣進(jìn)行上述RTPCR操作，確定該方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 毒株分離 HA檢測(cè)證實(shí)分離毒具有血凝性，效價(jià)為4～51og2。HI交叉抑制試驗(yàn)表明其與AIV、NDV、IBV、EDS均無(wú)交叉反應(yīng)。經(jīng)隨機(jī)引物擴(kuò)增，序列測(cè)定、blast比對(duì)確定其為APMV-4病毒。

2.2 RT-PCR 擴(kuò)增 APMV-4分離毒株P(guān)CR擴(kuò)增得到預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，約0.8kb。對(duì)照組GM NDV（即APMV-1病毒）在此處未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖1。

2.3 敏感性試驗(yàn) 將分離毒株原液進(jìn)行10倍的倍比稀釋?zhuān)S后同樣進(jìn)行RT-PCR操作。擴(kuò)增結(jié)果顯示本方法的檢測(cè)最小量可為102EID50，說(shuō)明建立的檢測(cè)方法靈敏性較好。

圖1 一步法RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床應(yīng)用 選取14份動(dòng)物攻毒試驗(yàn)后的組織樣品進(jìn)行上述One-step RT-PCR方法的檢測(cè)。結(jié)果檢測(cè)出了11株陽(yáng)性樣品，經(jīng)序列比對(duì)證實(shí)為APMV-4病毒。

3 討論

針對(duì)APMV-4的研究較少，國(guó)內(nèi)只檢索到其熒光定量檢測(cè)方法的文章[3]。近幾年來(lái)從香港、韓國(guó)、南非等地陸續(xù)有家養(yǎng)禽、野禽等分離到毒株的報(bào)道[4,5]。APMV 2～9誘導(dǎo)NDV感染的機(jī)體產(chǎn)生的免疫保護(hù)能力也不盡相同[6]。SH Kim等構(gòu)建了APMV-4的反向遺傳系統(tǒng)，證實(shí)F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列并不是病毒感染力的決定因素[7]。

本文建立了可用于檢測(cè)APMV-4的一步法RT-PCR方法，該方法能克隆微量mRNA而不需構(gòu)建cDNA文庫(kù)，即cDNA合成與PCR反應(yīng)在同一Buffer及酶中進(jìn)行，減少了反應(yīng)時(shí)間。特異性試驗(yàn)表明本方法特異性強(qiáng)，與新城疫病毒(NDV)無(wú)交叉反應(yīng)；靈敏度高，檢測(cè)最小量可為102EID50。因此，本文所建立的一步法的RT-PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可用于APMV-4樣品的檢測(cè)，非常適合基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

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食尚資訊 冬季食療養(yǎng)生首選海參，海參哪些吃法最受歡迎

冬季滋補(bǔ)吃什么？大雪掀起海參熱。

在大連、山東一帶，許多人剛過(guò)秋天就開(kāi)始囤購(gòu)海參，因?yàn)楹⒅懈缓陌被帷⒑Ｔ逅氐扔兄谌藗兲岣叩钟膊〉哪芰?，減少病毒性感冒的患病幾率，也能減少陳年疾病的復(fù)發(fā)。就病理生理學(xué)方面而言，首先，冬天氣溫低，毛細(xì)管收縮，外周阻力增大，高血壓，腦溢血的風(fēng)險(xiǎn)有所增加，而研究表明海參有明顯的舒展血管的功效；其次，冬天人們的運(yùn)動(dòng)量明顯減少，寒冷還容易使人內(nèi)分泌失調(diào)，誘發(fā)支氣管炎、肺炎等，海參的粘多糖有提高人體免疫力的作用。在滋補(bǔ)養(yǎng)生方面，海參更具有“八珍之首”之稱(chēng)，可以養(yǎng)血潤(rùn)燥、補(bǔ)腎固本。

保全營(yíng)養(yǎng)不流失，海參做法有講究。

海參是一種低膽固醇、低脂肪、高蛋白的食物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，為了在食用過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分最大吸收，海參的做法也很有講究。宮品海參相關(guān)負(fù)責(zé)人向我們介紹了海參的常見(jiàn)做法：

一、燉是海參最正確、最健康的做法。海參與瘦豬肉、雞肉、羊肉一起小火燉煮或煲湯，肉質(zhì)鮮嫩，湯汁鮮美，能緩解腸燥便秘、小便頻數(shù)。切記高溫，容易導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分的分解流失。

二、熬粥也是冬季海參的最佳食用方法之一。配上枸杞、胡蘿卜等熬粥，味道鮮美，有利于海參自身營(yíng)養(yǎng)的釋放，并且容易操作。

三、水煮海參的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值雖不及前兩種，但寒冬臘月，水煮海參確也不失為一種家常的做法，方便快捷，先武火燒沸，在文火煮上半小時(shí)即可。

四、海參的錯(cuò)誤打開(kāi)方式，海參最忌諱紅燒，因?yàn)榧t燒會(huì)使?fàn)I養(yǎng)成分大量流失，滋補(bǔ)效果大大降低。另外，做海參時(shí)切忌使用高壓鍋，鍋內(nèi)過(guò)高的溫度也會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失。