泛耐藥鮑曼不動桿菌β—內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥機(jī)制研究

鮑群麗　汪宏良　柯俊

摘要：目的 探討一組泛耐藥鮑氏不動桿菌β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥機(jī)制。方法 收集2015年1月～6月湖北省黃石市中心醫(yī)院（A）住院患者中分離的20株泛耐藥鮑氏不動桿菌，用mdfA測序確認(rèn)菌種，再采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法分析32種β-內(nèi)酰胺類藥物獲得性耐藥基因、1種膜孔蛋白carO基因、1種獲得性外排泵adeB泵蛋白基因。結(jié)果 20株泛耐藥鮑氏不動桿菌共檢出4種β-內(nèi)酰胺類獲得性耐藥基因，A類β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、C類β-內(nèi)酰胺酶基因ADC、D類β-內(nèi)酰胺酶基因OXA-23、OXA-51，四者陽性率均為100.00%；B類β-內(nèi)酰胺酶基因未檢出；膜孔蛋白carO基因缺失率為100.00%，外排泵adeB基因陽性率為95.00%。結(jié)論 泛耐藥鮑氏不動桿菌中攜帶的耐藥基因和耐藥表型相對應(yīng)，對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥與產(chǎn)TEM、ADC、OXA-23、OXA-51β-內(nèi)酰胺酶基因，膜孔蛋白carO基因缺失和獲得外排泵adeB3種耐藥機(jī)制有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鮑氏不動桿菌；β-內(nèi)酰胺酶基因；膜孔蛋白基因；外排泵adeB基因；泛耐藥

中圖分類號：R446.5；R450 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）26-0031-04

Abstract：Objective To investigate the drug resistance mechanism of a group of Pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii β-lactam antibiotics. Methods 20 strains of Pan-drug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from hospitalized patients in central hospital of Huangshi（A） in Hubei province from January to June 2015 were collected.The strains were confirmed by mdfA sequencing，and then polymerase chain reaction（PCR） The results showed that there were 32 β-lactam drug resistance genes， 1 membrane pore protein carO gene and 1 adaptive efflux pump adeB pump gene.Results 20 strains of pan-resistant acinetobacter baumannii were detected four kinds of β-lactam acquired resistance genes，class A β-lactamase gene TEM，C-type β-lactamase gene ADC，D-type β-lactamase gene OXA-23，OXA-51，the four were 100.00% positive rate；The amidase gene was not detected；membrane hole protein carO gene deletion rate was 100.00%，efflux pump adeB gene positive rate was 95.00%.Conclusion The resistance genes and drug resistance phenotypes carried by the drug-resistant acinetobacter baumannii strains correspond to β-lactam drug resistance and the production of TEM，ADC，OXA-23 and OXA-51β-lactamase genes，deletion of membrane pore protein carO gene and efflux pump adeB3 resistance mechanism.

Key words：Acinetobacter baumannii；β-lactamase gene；Membrane porin gene；Efflux pump adeB gene；Pan-drug resistance

繼臨床分離到多藥耐藥的鮑氏不動桿菌（MDRAB）后，更嚴(yán)重的泛耐藥鮑氏不動桿菌（XDRAB）與全耐藥鮑氏不動桿菌（PDRAB）在國內(nèi)外都有分離報告[1-5]。為全面了解XDRAB β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥機(jī)制，我們對分離自湖北省黃石市中心醫(yī)院20株XDRAB進(jìn)行了13種A類β-內(nèi)酰胺酶基因、10種B類β-內(nèi)酰胺酶基因（金屬β-內(nèi)酰胺酶）、2種C類β-內(nèi)酰胺酶基因（AmpC酶）、8種D類β-內(nèi)酰胺酶基因和膜孔蛋白carO基因以及外排泵adeB基因檢測，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1 一般資料

20株XDRAB均分離自2015年1月～6月我院住院患者各種標(biāo)本鑒定的菌株，每位患者一株菌。

1.2 菌種鑒定和藥敏試驗

全部XDRAB經(jīng)鮑氏不動桿菌種特異基因mdfA檢測確認(rèn)。藥敏試驗采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測定菌株對抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品，培養(yǎng)基為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，結(jié)果判斷按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）2013版執(zhí)行。

1.3 細(xì)菌DNA制備

蛋白酶K水解離心快速裂解法。挑純培養(yǎng)菌落置0.5 ml離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200 ng/ml蛋白酶K溶液400 μl），56 ℃水浴2 h，改95 ℃水浴10 min，即為基因檢測模板液，-20 ℃冰箱保存。endprint

1.4 基因檢測

20株XDRAB耐藥元件檢測項目：32種β-內(nèi)酰胺酶編碼基因（blaTEM、blaSHV、blaKPC、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群、blaCTX-M-8群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-25群、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、 blaRTG、blaIMP、blaVIM、blaDIM、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blaAIM、blaNDM、blaKHM、blaTMB、blaDHA、 blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaOXA-10群、blaOXA-20群、blaOXA-23群、blaOXA-24群、blaOXA-51群、 blaOXA-58群）、1種膜孔蛋白carO編碼基因以及獲得性外排泵泵蛋白adeB編碼基因，檢測均為PCR法?；蛞镒R別序列和目的產(chǎn)物長度，見表1。上述參數(shù)、靶基因全部PCR引物序列由無錫新區(qū)虎馬生物信息學(xué)工作室設(shè)計并獲授權(quán)使用，商品化基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.5 樣本聚類分析

測得結(jié)果作樣本聚類分析（UPGMA法）。樣本聚類分析由無錫新區(qū)虎馬生物信息學(xué)工作室完成

2結(jié)果

2.1基因檢測結(jié)果

20株XDRAB經(jīng)32種β-內(nèi)酰胺酶基因檢測，均檢出A類β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、C類β-內(nèi)酰胺酶基因ADC、D類β-內(nèi)酰胺酶基因OXA-23，OXA-51，即TEM、ADC、OXA-23，OXA-51陽性率均為100.00%，B類β-內(nèi)酰胺酶基因未檢出。20株XDRAB膜孔蛋白carO基因缺失率100.00%，檢出外排泵adeB基因，陽性率為95.00%，見表2。

2.2 陽性耐藥基因電泳圖

陽性耐藥基因（TEM、OXA-23、carO、ADC、adeB、OXA-51）PCR電泳圖，見圖1。

2.3 耐藥元件樣本聚類分析

A-黃石市中心醫(yī)院，A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20代表20株細(xì)菌，見圖2。

3討論

我院臨床分離的20株泛耐藥鮑氏不動桿菌中，12株來源于重癥監(jiān)護(hù)病房，8株來源于神經(jīng)外科病房，這可能與多種因素相關(guān)：如各種侵入性操作如氣管插管、導(dǎo)尿管的使用；導(dǎo)管留置時間延遲；患者免疫功能低下；細(xì)菌變異；抗菌藥物不合理使用等，應(yīng)引起臨床醫(yī)護(hù)人員高度重視，避免暴發(fā)性醫(yī)院感染的發(fā)生。

導(dǎo)致革蘭陰性桿菌β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的機(jī)制主要有：①產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，并釋放到革蘭陰性桿菌周質(zhì)空間，滅活經(jīng)外膜膜孔流入的β-內(nèi)酰胺類藥物，β-內(nèi)酰胺酶按酶蛋白序列聚類可分為A、B、C、D4類。②革蘭陰性桿菌外膜膜孔蛋白缺陷，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物進(jìn)入減少或無法進(jìn)入。③革蘭陰性桿菌內(nèi)膜上的外排泵蛋白編碼基因突變，導(dǎo)致外排β-內(nèi)酰胺類藥物能力増強(qiáng)或額外獲得外排泵。④青霉素結(jié)合蛋白各種亞單位編碼基因突變，突變導(dǎo)致PBPs構(gòu)象改變，β-內(nèi)酰胺類藥物與構(gòu)象改變的PBPs結(jié)合力下降而耐藥。盡管國內(nèi)對耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物鮑氏不動桿菌已有較多β-內(nèi)酰胺酶基因檢測報道，但同時涉及膜孔蛋白carO基因和外排泵adeB基因的報道較為少見[6-8]。

本研究20株XDRAB檢出TEM、ADC、OXA-23、OXA-51陽性率均為100.00%。B類金屬β-內(nèi)酰胺酶基因未檢出。本研究作了10種B類β-內(nèi)酰胺酶基因檢測，包括新型金屬β-內(nèi)酰胺酶AIM、KHM、TMB、IMP、VIM等均為陰性。carO基因編碼鮑氏不動桿菌碳青霉烯類藥物特異性膜孔蛋白carO[9-11]。本組20株XDRAB膜孔蛋白carO基因缺失率達(dá)100.00%， 陽性耐藥基因PCR電泳圖。

細(xì)菌的外排泵系統(tǒng)可分為5大類：耐受-生節(jié)-分裂家族（RND）、多藥物與毒物外排家族（MATE）、藥物與代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族（DMT）及與之相關(guān)的小多藥外排家族（SMR）、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（ABC），除ABC為能量泵外，其余均為質(zhì)子泵[12-13]。adeABC外排泵系統(tǒng)外排β-內(nèi)酰胺類藥物、氨基糖苷類藥物、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素[14-16]。adeB基因為ade ABC外排泵泵蛋白的編碼基因。由實驗可見，本組PDRAB對頭孢類藥物（包括碳青霉烯類藥物）均耐藥，與產(chǎn)TEM、ADC、OXA-23、OXA-51β-內(nèi)酰胺酶，膜孔蛋白carO基因缺失和獲得ade B 外排泵3耐藥機(jī)制相關(guān)。

本研究分離菌株耐藥元件檢測結(jié)果的樣本聚類分析可見， A院20株XDRAB分不同的簇群，由二個克隆傳播，A院的A1- A2-A3-A4-A5-A6-A7-A9-A12-A14-A15-A16-A17-A19-A20等15株為同一克隆，構(gòu)成大暴發(fā)，A8-A11-A18等3株亦為同一克隆。本研究提示，XDRAB應(yīng)引起足夠的關(guān)注，它們攜帶的獲得性耐藥基因可能會加劇其它革蘭陰性桿菌的耐藥性，因此加強(qiáng)醫(yī)院感染控制的措施是必須的。

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