混合脫鈣液與EDTA脫鈣液對骨組織切片HE染色影響的分析

吳拮　孫立國　趙成相

摘要：目的 比較不同脫鈣液對骨組織的脫鈣能力的差異，探討其對HE染色的影響。方法 選取16例大鼠脛骨標(biāo)本，運用兩種常用的脫鈣液（混合脫鈣液和EDTA脫鈣液）進(jìn)行脫鈣，比較其脫鈣效果和對HE染色的影響。結(jié)果 兩種脫鈣液對骨組織的脫鈣能力、HE染色效果影響有顯著區(qū)別。結(jié)論 混合脫鈣液時間最短，但切片和染色效果最差；EDTA脫鈣液對骨組織損傷小，HE染色效果最好，但用時較長。

關(guān)鍵詞：混合脫鈣液；EDTA脫鈣液；HE染色

中圖分類號：R361 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）26-0180-02

Abstract：Objective To compare the difference of different decalcifying fluid on bone decalcification ability，and to investigate its effect on HE staining.Methods 16 cases of rat tibia specimens， using two kinds of decalcifying fluid（mixture of decalcifying fluid and EDTA decalcifying fluid） were decalcified，compare the decalcification effect and the effects on HE staining.Results Two decalcification of bone tissue decalcification ability， HE staining effect has significant difference.Conclusion Mixed decalcifying fluid in the shortest time，but the sectioning and staining effect is the worst；EDTA decalcification of bone HE staining had the best effect，but with a longer time.

Key words：Mixed decalcification solution；EDTA decalcification liquid；HE staining

骨組織是一種堅硬的結(jié)締組織，由骨細(xì)胞和骨基質(zhì)組成。骨基質(zhì)內(nèi)含大量無機(jī)鹽，質(zhì)地堅硬，不能直接進(jìn)行石蠟或冷凍切片，因此在制作病理切片過程中，常常需要經(jīng)過脫鈣處理，才能進(jìn)行切染色[1]。試驗中脫鈣過度或不足會影響染色效果，嚴(yán)重影響結(jié)果的判讀，因此，脫鈣時間和脫鈣液的選擇十分重要。為了更好地了解脫鈣技術(shù)對骨組織切片HE染色結(jié)果的影響，本文重點對比SD大鼠脛骨上段骨組織通過兩種不同脫鈣液的脫鈣以及HE染色效果進(jìn)行對比，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)本為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科動物實驗中心提供的大鼠8只。取雙側(cè)脛骨上端16例標(biāo)本，長約0.8 cm，用紗布包好隨機(jī)標(biāo)記為A組和B組，在10%中性福爾馬林固定3 d，投入脫鈣液中，A組為EDTA脫鈣液，B組為混合脫鈣液。儀器：雅博全自動脫水機(jī)；德國Leica石蠟切片機(jī)，Thermo全自動染色機(jī)。

1.2脫鈣液配制

A組：EDTA186g加蒸餾水至1000 ml，加NaOH攪拌溶解調(diào)節(jié)至pH8.0。B組：蒸餾水360 ml，依次加入氯化鈉4.5 g，結(jié)晶氯化鋁30 g攪拌溶解，再加入鹽酸40 ml，甲醛50 ml，冰醋酸12.5 ml，甲酸35 ml攪拌混勻。

1.3方法

1.3.1脫鈣及脫鈣終點標(biāo)本用兩種不同脫鈣液在常溫通風(fēng)下進(jìn)行脫鈣，每間隔3 d更換一次脫鈣液，當(dāng)用手術(shù)縫針輕松無阻力穿過組織或可用手術(shù)刀輕力切開即為脫鈣完成。A組流水沖洗30 min后脫水石蠟包埋。B組脫鈣完成后，流水沖洗12 h以上后脫水石蠟包埋。包埋好的蠟塊，利用Leica石蠟切片機(jī)切片，切片厚度為6 um，即可進(jìn)行HE染色。

1.3.2脫水染色HE染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，置于蘇木精染液10 min，水洗2 min，用1%鹽酸乙醇分化15 s，水洗2 min，稀氨水返藍(lán)1 min，水洗2 min，80%乙醇1 min，伊紅2 min，水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封固。

2結(jié)果

2.1脫鈣時間

EDTA脫鈣液脫鈣時間長，約3 w。混合脫鈣液脫鈣時間短，約1 w。

2.2組織損傷程度

EDTA脫鈣液對骨組織損傷小，標(biāo)本脫鈣均勻完全，不破壞組織細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)。混合脫鈣液脫鈣比較完全，但不均勻，切片局部有面粉樣組織，對骨組織損傷大，破壞組織結(jié)構(gòu)。

2.3染色效果

EDTA液脫鈣脫鈣后，切片完整，HE染色均勻，顏色鮮艷，細(xì)胞核著色清晰，見圖1、圖2。混合脫鈣液脫鈣后，切片不完整，且有刀痕，部分有掉片或重疊現(xiàn)象，HE染色欠鮮艷，細(xì)胞核顏色為深黑色，結(jié)構(gòu)欠清晰，見圖3、圖4。

3 討論

脫鈣是利用化學(xué)或物理方法，將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維進(jìn)行分離“除去鈣鹽”。使骨組織軟化，目的是獲得完整的骨切片。常用的脫鈣劑主要抱括單純酸類、混合酸類、螯合劑等[2]。選擇脫鈣液是制作骨切片的重要環(huán)節(jié)，即要切出完整的切片，又要能完整的保存骨組織內(nèi)部成分的完整性。對組織內(nèi)的酶、抗原都有一定保護(hù)作用。

目前有兩種脫鈣液應(yīng)用多年，即混合脫鈣液和EDTA脫鈣液?；旌厦撯}液目前臨床使用最廣，主要是因為其脫鈣能力強，脫鈣時間短，但這也使得骨組織的脫鈣程度較難掌握，往往造成過度脫鈣[3]。同時，它參透能力差，對骨組織特別是比較硬的骨組織滲透能力更差，出現(xiàn)脫鈣不均勻，部分標(biāo)本切片出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象，制片易出現(xiàn)“刀痕”，影響觀察。而脫鈣時間長對骨組織的酶類物質(zhì)、抗原等又有一定的破壞性，對組織損傷大，容易破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，切片時易散碎，染色欠清晰，影響染觀察[4-5]。endprint

隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展對組織學(xué)制作提出更高的要求，混合脫鈣液越來越不適應(yīng)發(fā)展的要求。而EDTA脫鈣液能與鈣形成一種可溶性非離子化的復(fù)合物，pH接近中性時可發(fā)生螯合作用。EDTA的優(yōu)越性在于骨組織不會被氣泡破壞，而且脫鈣后染色酶不會被破壞，分化好，因此可用作骨組織相關(guān)酶類組織化學(xué)的研究。另外，EDTA是一種作用緩慢的脫鈣劑，需要作用時間較長，故適用非速檢標(biāo)本。它的脫鈣作用很強，除鈣質(zhì)外，組織中的其它金屬如鐵、鎂、鋁等亦能被除去[6-8]。

本實驗中由于脛骨組織具有皮質(zhì)骨硬，骨小梁易斷的特點，如果脫鈣不徹底可導(dǎo)致切片破碎、裂斷。實驗中用EDTA脫鈣液，脫鈣均勻，切片完整，染色鮮艷，著色效果好，保持良好細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)，尤其是對免疫組化染色，能保存細(xì)胞的抗原性和部分酶類的活性。

在整個制作過程中應(yīng)注意以下幾點：①取材時骨組織塊不易過厚，一般在6 mm左右，以免脫鈣時產(chǎn)生過長影響染色效果；②脫鈣液要充足，一般為標(biāo)本體積的20倍，換脫鈣液1次/2 d；③脫鈣時將瓶口不要蓋嚴(yán)，在通風(fēng)處放置，這樣會縮短脫鈣時間；④切片時刀要鋒利，最好是一次性刀片，不要有劃痕；⑤染色時特點注意水洗步驟，流水沖洗時不要對著組織沖洗，以免脫片[9]。

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編輯/李樺endprint