2種復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)大海馬幼魚生長(zhǎng)存活及水質(zhì)影響

羅杰，李鋒，劉皓，曹伏君，王中鐸，袁吉貴

（廣東海洋大學(xué)南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

海馬是一種小型海洋魚類，分布于內(nèi)海海藻、海草生長(zhǎng)繁茂的地方，以攝食小型甲殼類動(dòng)物為主，我國(guó)沿海常見有大海馬、線紋海馬、三斑海馬、小海馬和刺海馬5種[1]。海馬由于個(gè)體較小，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)在藥用方面，在我國(guó)素有“北方人參，南方海馬”之稱。隨著近海污染的加劇和人類對(duì)近岸海域過(guò)度開發(fā)，導(dǎo)致天然餌料數(shù)量減少及棲息環(huán)境惡化，而更為嚴(yán)重的是人類對(duì)海馬需求量日益增多而過(guò)度捕撈，其自然資源數(shù)量急劇減少[2]，世界生物保護(hù)組織把所有已知的33種海馬均列入瀕危野生動(dòng)植物種[3]，我國(guó)2004年5月把海馬列入Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物。因此，進(jìn)行海馬人工繁育及養(yǎng)殖技術(shù)研究尤為重要。大海馬（Hippocampus kuda）是我國(guó)海馬養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖品種，經(jīng)多年研究，在海馬人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)[4-12]、形態(tài)及生理生態(tài)學(xué)[13-18]、分子生物學(xué)[19-20]等方面研究取得較大進(jìn)展，但其人工育苗及養(yǎng)殖成活率偏低的問(wèn)題仍未得到有效的解決，而養(yǎng)殖過(guò)程中由于殘餌、管理不科學(xué)等原因造成水體中 pH、化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH4+-N）、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的大量積累，導(dǎo)致水體惡化，誘導(dǎo)疾病的發(fā)生，是大海馬人工育苗及養(yǎng)殖成活率偏低的原因之一。

微生態(tài)制劑（probiotics）也叫活菌制劑（bigone）或益生菌，是一類能夠調(diào)整微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進(jìn)宿主正常菌群生長(zhǎng)的制劑總稱[21]。用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生態(tài)制劑主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、EM菌等，具有抗病、促生長(zhǎng)、凈化水質(zhì)、提高免疫功能、無(wú)毒無(wú)不良作用、無(wú)殘留、成本低、效果顯著、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[22-23]，對(duì)養(yǎng)殖水體修復(fù)[24]、提高水產(chǎn)動(dòng)物人工育苗及養(yǎng)殖成活率、病害防控[25-32]等方面效果顯著。本文在大海馬人工育苗及養(yǎng)殖期間，通過(guò)投放在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的2種復(fù)合微生態(tài)制劑AQ菌和EM菌，研究二者對(duì)大海馬幼魚生長(zhǎng)、存活及水質(zhì)的影響，以期為微生態(tài)制劑在海馬人工養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供更為詳實(shí)的資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)施

實(shí)驗(yàn)在湛江溢鑫源水產(chǎn)科技有限公司水產(chǎn)種苗繁育基地進(jìn)行，所用的大海馬幼魚由基地提供，體長(zhǎng)（1.13±0.07）cm，試驗(yàn)海水溫度 28.5～29.2 ℃、鹽度（30.0±0.5）、pH 值 8.2，經(jīng)沉淀、砂濾后使用。

二種復(fù)合微生態(tài)制劑分別為AQ菌和EM菌，其中AQ菌為上海綠奧生物科技有限公司生產(chǎn)，粉末狀，包括Bacillus mageterium、硝化細(xì)菌、芽孢桿菌等多種有益菌及復(fù)合酶、營(yíng)養(yǎng)劑，有效活菌含量不低于 20×108CFU/g；EM菌由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生產(chǎn)，主要成分為乳酸菌、酵母菌、放線菌、沼澤紅假單胞菌、絲狀菌等有益菌，活菌總數(shù)大于30×108CFU/mL。AQ菌加水配制成菌液后使用，配制比例為1 g/m3（固體粉末）=1 mL/m3（液體菌液）。

實(shí)驗(yàn)所用的水泥池大小為1.0 m×1.0 m×1.0 m，每池安放2個(gè)氣石，微沖氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)在小水泥池中進(jìn)行，水泥池經(jīng)消毒處理，加入經(jīng)砂濾的海水90 cm。設(shè)1個(gè)沒有投放復(fù)合微生態(tài)制劑的空白對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組，其中試驗(yàn)組A加入微生態(tài)制劑AQ菌4.5 mL，試驗(yàn)組B加入EM菌3.0 mL，使養(yǎng)殖水體中有益菌濃度約為1×104CFU/mL，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每個(gè)小水泥池投放大小為（1.13±0.07）cm的大海馬幼魚250尾，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為35 d。

1.2.2 日常管理 每天上午用虹吸方法把池中的臟物、殘餌吸掉，死魚及時(shí)撈出，然后換水，換水量為50%～60%，換的水溫盡量與原水溫保持一致，防止溫差變化太大造成應(yīng)激反應(yīng)，根據(jù)換水量的多少追加投放適量的微生態(tài)制劑，使水體中的有益菌濃度維持在1×104CFU/mL左右。餌料主要為鹵蟲幼體、糠蝦等，每天投餌3次，每次以水中有少量剩餌為宜。

1.3 生長(zhǎng)及水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取15尾海馬幼魚用游標(biāo)卡尺測(cè)量體長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)存活的幼魚數(shù)量，最后計(jì)算體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率R（%/d）及成活率A（%）：

式中Ht、H0分別為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)幼魚的平均體長(zhǎng)、起始體長(zhǎng)，d為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

A=（實(shí)驗(yàn)各階段或結(jié)束時(shí)幼魚存活數(shù)/實(shí)驗(yàn)起始幼魚總數(shù)）×100%。

每隔5 d，在換水前測(cè)定試驗(yàn)池中的pH值、COD、NH4+-N和NO2--N含量，測(cè)定儀器及方法分別采用美國(guó)OHRUS ST10型酸度計(jì)、高錳酸鉀法、次溴酸鈉氧化法（以722s紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光值）、鹽酸萘乙二胺比色法[33]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，利用Duncan進(jìn)行多重分析比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異水平規(guī)定為P＜0.05。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SE）。

2 結(jié)果

2.1 不同微生態(tài)制劑對(duì)大海馬幼魚生長(zhǎng)的影響

經(jīng)過(guò)35 d實(shí)驗(yàn)，投放AQ菌、EM菌和對(duì)照組的大海馬幼魚生長(zhǎng)、存活結(jié)果見表1。從表1中可以看到，對(duì)照組的幼魚體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率最低，而投放AQ菌、EM 菌組的分別為 （12.79±1.87）%/d、（13.22±1.52）%/d，EM菌組幼魚比對(duì)照組的體長(zhǎng)增加了5.8%。Duncan多重顯分析比較，投放微生態(tài)制劑的A、B組的大海馬幼魚體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而A、B兩組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在成活率方面，A、B組相差不大，對(duì)照組最低，只有51.6%，但與A、B組相比較，成活率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)大海馬幼魚生長(zhǎng)與存活的影響

2.2 不同微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的影響

圖1 不同微生態(tài)制劑處理水體中pH的變化

2.2.1 pH值含量的影響 從圖1中看出，兩種微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體的pH值具有明顯的提高作用。試驗(yàn)到第5天，pH值的差異就逐漸顯示出來(lái)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組的pH值下降至7.4，而兩種微生態(tài)制劑AQ、EM的pH值始終處于7.7～8.2之間，保持在動(dòng)物較佳生長(zhǎng)范圍。多重分析比較，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05）。

2.2.2 水體中化學(xué)需氧量（COD）含量的影響 對(duì)照組、投放微生態(tài)制劑的實(shí)驗(yàn)組對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中化學(xué)需氧量（COD）含量影響見圖2，投放微生態(tài)制劑對(duì)水體中的化學(xué)需氧量具有明顯的降低作用。沒有施放微生態(tài)制劑的對(duì)照組，從第5天開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，COD始終處于上升狀態(tài)，結(jié)束時(shí)達(dá)到4.68 mg/L，與實(shí)驗(yàn)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＜0.05）；而EM、AQ組，水體中COD的含量保持在較低水平，尤其是EM組效果更好，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)只有3.23 mg/L，比對(duì)照組降低了31%。但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05）。

2.2.3 水體中氨氮（NH4+-N）含量的變化 微生態(tài)制劑對(duì)水中NH4+-N含量的影響見圖3。實(shí)驗(yàn)組EM、AQ水體中NH4+-N的含量只是緩慢上升，始終維持在0.118～0.204 mg/L，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＞0.05）；而對(duì)照組的NH4+-N含量變化幅度較大，結(jié)束時(shí)其含量達(dá)到0.423 mg/L，與加入復(fù)合微生態(tài)制劑組最低相比，水體中NH4+-N含量增加了107.4%，而且表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＜0.05）。

圖2 水體中化學(xué)需氧量（COD）含量的變化

圖3 水體中氨氮（NH4+-N）含量的變化

2.2.4 水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）含量的變化從圖4中可見，微生態(tài)制劑可明顯降低水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）的含量。實(shí)驗(yàn)第5天，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組水中NO2--N含量相差不大，而隨著實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)，微生態(tài)微制劑組與對(duì)照組水中NO2--N的含量表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＜0.05），至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)沒有加入微生態(tài)制劑的對(duì)照組水中NO2--N為0.183 mg/L，是含量最低（只有0.058 mg/L）的微生態(tài)制劑AQ的3倍多。

圖4 水體中亞硝酸鹽氮（NO2--N）含量的變化

3 結(jié)論與討論

水生動(dòng)物在養(yǎng)殖過(guò)程中，由于自身的排泄、人工投餌等諸多因素影響，致使水體中氨氮、H2S、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量不斷積累，增加了水產(chǎn)動(dòng)物患病的風(fēng)險(xiǎn)。水產(chǎn)動(dòng)物傳統(tǒng)的防病治病常常采用投放過(guò)量的抗生素，實(shí)踐證明，過(guò)多使用抗生素，一些常見的水產(chǎn)動(dòng)物病害已產(chǎn)生抗藥性及可導(dǎo)致動(dòng)物自身免疫力下降，破壞養(yǎng)殖水體的生態(tài)系統(tǒng)，同時(shí)抗生素對(duì)環(huán)境容易造成污染、影響水產(chǎn)動(dòng)物的風(fēng)味等。因此，微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用受到越來(lái)越多的養(yǎng)殖者青睞，它具有無(wú)毒、無(wú)不良作用、無(wú)殘留和不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，能夠有效改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，調(diào)節(jié)水體質(zhì)量、消除氨氮等污染、增強(qiáng)養(yǎng)殖對(duì)象的免疫力，在健康水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮十分重要的作用。

3.1 微生態(tài)制劑對(duì)大海馬幼魚生長(zhǎng)與存活的影響

由于微生態(tài)制劑本身含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)隨著它們?cè)趧?dòng)物消化道內(nèi)的定植、繁衍和代謝，可產(chǎn)生動(dòng)物生長(zhǎng)所需的維生素、氨基酸、促生長(zhǎng)因子以及蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維酶等多種酶，從而增強(qiáng)養(yǎng)殖對(duì)象的營(yíng)養(yǎng)代謝，增加機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的消化利用，促進(jìn)其生長(zhǎng)。

另一方面，微生態(tài)制劑還可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制有害細(xì)菌，從而起到預(yù)防病害的作用[25]。大量的研究結(jié)果表明，在養(yǎng)殖水體中施加微生態(tài)制劑可促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)及增加其免疫力。武鵬等[25]研究了3種微生態(tài)制劑對(duì)水質(zhì)及刺參幼參生長(zhǎng)的影響，微生態(tài)制劑均能提高幼參的特定生長(zhǎng)率，同時(shí)提高幼參體腔液中的酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶、溶菌酶活力；在凡納濱對(duì)蝦育苗中，投放微生態(tài)制劑可縮短幼體變態(tài)時(shí)間和提高成活率[34]；在牙鲆幼魚養(yǎng)殖中加入微生態(tài)制劑，可顯著提高牙鲆幼魚消化道的蛋白酶活性，對(duì)牙鲆幼魚生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用[35]。本試驗(yàn)從表1中可以看出，同一規(guī)格的大海馬幼魚經(jīng)過(guò)35 d的養(yǎng)殖試驗(yàn)，在加入微生態(tài)制劑的A、B組，大海馬幼魚的特定生長(zhǎng)率均比對(duì)照組的高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異（P＜0.05）；兩種微生態(tài)制劑都可以提高大海馬幼魚的成活率，但與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。微生態(tài)制劑能夠提高水產(chǎn)動(dòng)物的成活率，在相關(guān)研究文獻(xiàn)中已經(jīng)得到證實(shí)[36-37]。

3.2 微生態(tài)制劑對(duì)養(yǎng)殖水體中pH、COD、NH4+-N和NO2--N含量影響

在水體中加入微生態(tài)制劑，其中的有益微生物能夠發(fā)揮其氧化、氨化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用，迅速分解水中的排泄物、殘餌、動(dòng)植物殘骸等有機(jī)物，降低氨態(tài)氮、硫化氫、COD等有害物質(zhì)的含量，并可通過(guò)反硝化作用去除亞硝酸鹽等污染物，間接增加水中的溶氧量。另外，通過(guò)加入有益微生物形成優(yōu)勢(shì)種群，與有害病原菌形成競(jìng)爭(zhēng)，限制其生長(zhǎng)，而且部分有益微生物的代謝產(chǎn)物具有殺菌抑菌作用，從而達(dá)到預(yù)防水產(chǎn)疾病的作用。還有，微生態(tài)制劑可促進(jìn)養(yǎng)殖水體中原生動(dòng)物、輪蟲、枝角類等動(dòng)物性餌料大量繁殖，實(shí)現(xiàn)浮游植物的結(jié)構(gòu)由單一種群向多種群轉(zhuǎn)變，優(yōu)勢(shì)種類轉(zhuǎn)變?yōu)閱渭?xì)胞藻類。在降解淤泥、抑制有害微生物和有害藻類的繁殖、平衡養(yǎng)殖水體的微生態(tài)環(huán)境等方面可起到積極作用。微生態(tài)制劑通過(guò)以上途徑實(shí)現(xiàn)改善水質(zhì)。

試驗(yàn)中，無(wú)論是對(duì)照組還是加入微生態(tài)制劑的實(shí)驗(yàn)組，水體中pH、COD、NH4+-N和NO2--N的含量均隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，只不過(guò)實(shí)驗(yàn)組的增加比較緩慢，而對(duì)照組增加較快（見圖 1、2、3、4），可見微生態(tài)制劑可延緩水中pH下降，使其維持在一個(gè)適宜的范圍。同樣，微生態(tài)制劑對(duì)水體中的COD、NH4+-N和NO2--N只是起到一定的降解作用，并不能完全消除水中的有害物質(zhì)。2種微生態(tài)制劑EM菌和AQ菌由于其所含的有益菌種類不同，故二者對(duì)水中的COD、NH4+-N和NO2--N降解效果也有所差別，EM菌對(duì)降低COD、NH4+-N的含量效果較好，而AQ菌由于含有硝化細(xì)菌，其對(duì)NO2--N的降解效果更好。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，無(wú)論對(duì)大海馬幼魚的生長(zhǎng)還是對(duì)水中 pH、COD、NH4+-N和NO2--N含量的影響，EM菌和AQ菌的效果相差不大。在實(shí)際生產(chǎn)養(yǎng)殖中由于微生態(tài)制劑使用量較大，從經(jīng)濟(jì)效益出發(fā)，在二者中可以選擇價(jià)廉的進(jìn)行使用，以提高經(jīng)濟(jì)效益。

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