花生貯藏蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成、缺失與籽粒主要品質(zhì)間關(guān)系研究

張 岱 張智猛 丁 紅 康 濤 宋文武 戴良香

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院1，保定 071001)(山東省花生研究所2，青島 266100)(泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院3，泰安 271000)

花生是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物，其含蛋白質(zhì)24%～36%，其中90%為鹽溶性蛋白[1]，鹽溶性花生蛋白主要包括花生球蛋白(14S，類似于11S大豆球蛋白)、伴花生球蛋白Ⅱ(7.8S，類似于7S豌豆球蛋白)和伴花生球蛋白Ⅰ(2S)[2-3]。花生品種的蛋白質(zhì)研究一直受到人們的重視，關(guān)于花生種子貯藏蛋白組成、籽仁發(fā)育過(guò)程中貯藏蛋白質(zhì)組成的變化，以及不同基因型花生的球蛋白亞基組成的研究均有報(bào)道，不同品種的蛋白質(zhì)組分和亞基含量存在較大差異，但由于花生基因型的差異，采用的方法和分類依據(jù)等的不同，結(jié)果不很一致[4-11]。有關(guān)花生種質(zhì)間蛋白亞基缺失研究表明，不同基因型缺失的蛋白亞基略有不同，Shokraii等[12]發(fā)現(xiàn)部分花生品種存在36 ku亞基的缺失，杜寅[13]則發(fā)現(xiàn)雙紀(jì)2號(hào)、粵油14號(hào)、閩花9號(hào)等25個(gè)品種35.5 ku亞基缺失，Liang等[14]發(fā)現(xiàn)蘭娜型花生中缺失35 ku亞基，西班牙型品種缺失27 ku。由于球蛋白對(duì)于花生的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)影響作用較大，利用不同花生品種研究和了解我國(guó)花生種質(zhì)球蛋白的亞基組成與變異類型，對(duì)充分利用花生種質(zhì)資源，提高資源利用效率有非常重要的意義。本研究在對(duì)208份花生種質(zhì)資源的脂肪、粗蛋白質(zhì)、可溶性糖和淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)，分析了其貯藏蛋白亞基組成，旨在探索我國(guó)花生品種資源中主要營(yíng)養(yǎng)成分含量變化、蛋白亞基組成以及其相互間的關(guān)系，為花生種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與鑒定提供參考，為推動(dòng)優(yōu)質(zhì)花生蛋白資源的開發(fā)、提升花生蛋白產(chǎn)業(yè)整體效益提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試品種與材料

選用來(lái)自全國(guó)各地的花生品種或品系208份，由山東省花生研究所種質(zhì)資源中期庫(kù)、濟(jì)寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等提供(表1)。

實(shí)驗(yàn)在山東省花生研究所實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)地土壤類型為褐土，表層土壤質(zhì)地沙壤土，0～20 cm土壤肥力狀況：有機(jī)質(zhì)12.7 g/kg、水解N 89.3 mg/kg、速效P(P2O5)29.6 mg/kg、速效K(K2O)93.6 mg/kg。均于2012年5月8日播種，9月16日收獲。小區(qū)面積為32 m2，隨機(jī)排列，重復(fù)3次，穴播，行距40 cm，穴距18 cm，每穴2粒，常規(guī)田間管理。成熟后分小區(qū)收獲，晾干后分別選取有代表性飽滿莢果1 kg剝殼，籽仁備分析測(cè)定。

表1 供試花生品種及編號(hào)

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

脂肪含量的測(cè)定采用索氏法[15]，蛋白含量測(cè)定采用微量凱氏定氮法[16]，可溶性糖和淀粉含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[15]。每份材料重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。

1.3蛋白組分SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

采用BIO-RAD mini垂直板電泳槽進(jìn)行SDS-PAGE分析。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker采用中低分子量樣本，購(gòu)自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。采用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，在內(nèi)槽加入負(fù)極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，將20 μL樣品加入點(diǎn)樣孔。開始時(shí)電壓為15 V，待溴酚蘭完全到達(dá)分離膠與濃縮膠界面后，25 V恒壓電泳至結(jié)束。電泳后，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染5 h，再在脫色液中脫色，直到背景脫干凈為止。用蒸餾水浸泡，至背景無(wú)色，拍照。

1.4 缺失亞基成分分析

切取亞基缺失對(duì)應(yīng)的譜帶，依次進(jìn)行膠內(nèi)酶解(Trypsin，20 h)、抽提酶解肽段、ESI質(zhì)譜、軟件分析數(shù)據(jù)、鑒定蛋白質(zhì)。測(cè)試分析由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所蛋白質(zhì)研究分析中心進(jìn)行分析。

1.4.1 毛細(xì)管高效液相色譜方法

色譜柱以95%的甲酸水溶液(0.1%)平衡后，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到Trap柱。

0～50 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)線性梯度從4%到50%；50～54 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)線性梯度從50%到100%；54～60 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84%)維持在100%。

1.4.2 主要參數(shù)

LTQ Velos質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan,San Jose,CA)進(jìn)行質(zhì)譜分析。進(jìn)樣方式：Microspray，毛細(xì)管溫度：200 ℃，檢測(cè)方式：正離子，Trap柱：Zorbax 300SB-C18 peptide traps(Agilent Technologies,Wilmington,DE)，Column：0.15 mm×150 mm(RP-C18)(Column Technology Inc.)。

1.4.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜(MS2 scan)。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

原始文件用BIOWORKS軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)。搜索使用Viridiplantae蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，最后得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生貯藏蛋白質(zhì)SDS-PAGE譜帶多樣性

條帶的粗細(xì)、染色的深淺度有較大差異，表明各個(gè)亞基的含量具有顯著變化。圖1示出48個(gè)品種的電泳譜帶，可以說(shuō)明花生種質(zhì)資源或品種間貯藏蛋白電泳條帶數(shù)量的多樣性，表明花生蛋白種類和含量存在較高的多態(tài)性，品種間存在條帶缺失。圖1表明，各品種譜帶中的條帶數(shù)、各條帶的染色強(qiáng)度與面積存在很大差異。每個(gè)品種清晰可見(jiàn)的條帶為14～17條，平均為15條。各品種電泳譜帶均出現(xiàn)4條著色較深、面積較大的條帶，其余條帶均著色較淺，面積較小，這與不同類型貯藏蛋白的含量有關(guān)，但每個(gè)品種的清晰和不清晰的條帶均構(gòu)成了貯藏蛋白譜帶的連續(xù)性分布?；ㄉA藏蛋白電泳條帶的多樣性與品種中蛋白質(zhì)的多樣性有關(guān)，這可能是造成前人研究中因測(cè)試品種不同而獲得不同數(shù)量電泳條帶的主要原因。電泳條帶多樣性為改良花生蛋白質(zhì)構(gòu)成、培育加工專用品種創(chuàng)造了機(jī)遇。

注：a.自左至右依次為Mark、魯花11、魯花14、花育16號(hào)、花育17號(hào)、花育19號(hào)、花育20號(hào)、花育21號(hào)、花育22號(hào)、花育23號(hào)、花育24號(hào)、花育25號(hào)、花育27號(hào)；b.自左至右依次為Mark、花育28號(hào)、花育31號(hào)、花育32號(hào)、白沙1601、白花生、唐科8號(hào)、阜花10號(hào)、阜花11號(hào)、阜花13號(hào)、濰花6號(hào)、濰花8號(hào)、M5；c.自左至右依次為Mark1、Mark2、豐花5號(hào)、豫花15號(hào)、Z8、G2、H1、H3、Hx、16-8、16-9、HZ15、冀油1號(hào)、冀油2號(hào)；d.自左至右依次為豫花9號(hào)、豫花16號(hào)、?；?號(hào)、徐花5號(hào)、HLY3、HLY4、錦花5號(hào)、中花7號(hào)、粵油196、粵油35號(hào)、粵油79號(hào)、粵油26號(hào)、Mark。圖1 部分花生蛋白亞基組成SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 花生蛋白質(zhì)條帶缺失

花生貯藏蛋白各亞基分子質(zhì)量在14.4～97.4 ku之間，17條譜帶相對(duì)分子質(zhì)量分別為97.4、66.2、55.5、43.0、40.6、37.4、34.2、32.6、31.0、26.8、25.6、23.5、22.8、21.5、20.1、17.5和14.4 ku，僅有分子質(zhì)量為66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5條帶顏色深、面積大，其含量較高。同時(shí)，不同品種花生貯藏蛋白在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，在26.8、25.6 ku處或表現(xiàn)條帶缺失或表現(xiàn)明顯的顏色、面積和含量差異。

對(duì)供試的208份花生品種(系)和種質(zhì)進(jìn)行的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，有45份材料在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，占供試品種材料總數(shù)的21.65%，說(shuō)明花生品種(系)和種質(zhì)資源的球蛋白組份存在著豐富的遺傳變異，花生品質(zhì)育種中優(yōu)良基因有著廣闊的選擇范圍。

2.3 花生主要營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)含量

表2表明，花生脂肪含量平均值為50.14 g/100 g，含量范圍在39.56～58.96 g/100 g間；蛋白質(zhì)含量平均值為27.6 g/100 g，含量范圍為22.19～33.19g/100 g，其變異系數(shù)最小，僅為6.73；品種(系)間可溶性糖含量差異較大，平均含量為9.33 g/100 g，其最高含量為20.53 g/100 g，最低僅為6.78 g/100 g，其變異系數(shù)為13.55；淀粉含量的最大值為16.3g/100 g，其變異系數(shù)最大為46.96。

在分析的208個(gè)品種(系)中，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)55%的高油品種(系)有11個(gè)，分別為徐花5號(hào)(58.96 g/100 g)、HLY1(58.71 g/100 g)、HLY2(56.28 g/100 g)、HLY3(55.94 g/100 g)、HLY4(56.21 g/100 g)、HLY5(55.22 g/100 g)、HLN2(56.33 g/100 g)、HLL20(55.58 g/100 g)、金花1012(56.2 g/100 g)、E12(55.67 g/100 g)和遠(yuǎn)育1808(55.24 g/100 g)，其占分析樣本的5.26%；高蛋白含量品種(粗蛋白質(zhì)含量大于32 g/100 g)僅有3個(gè)，分別為A021(33.19 g/100 g)、550GFA-1(33.17 g/100 g)和粵油26(32.13 g/100 g)；而高于30.0 g/100 g的品種達(dá)31個(gè)；可溶性糖高于20.0 g/100 g的品種(系)為2個(gè)，分別為紅皮花生和豫花15。

表2 花生籽仁主要營(yíng)養(yǎng)成分含量/g/100 g

2.4 花生亞基缺失與品質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系

表3表明，花生籽仁蛋白質(zhì)、脂肪、可溶性糖和淀粉含量各品質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系不同，脂肪含量與蛋白質(zhì)和可溶性糖含量間均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系外，其余品質(zhì)指標(biāo)間均存在顯著或極顯著的相關(guān)關(guān)系；且淀粉含量與蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖間均表現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而可溶性糖與蛋白質(zhì)、脂肪含量間均表現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，脂肪與蛋白質(zhì)間表現(xiàn)不顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，淀粉和可溶性糖含量間的相關(guān)性最高，相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)-0.741 5；其次為淀粉與蛋白質(zhì)含量間的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為-0.399 1；淀粉與脂肪含量間的相關(guān)系數(shù)為-0.334 8，蛋白質(zhì)與可溶性糖含量間呈極顯著的正相關(guān)，但其相關(guān)系數(shù)較小，為0.320。說(shuō)明花生以蛋白質(zhì)含量為育種目標(biāo)選育品種,可能保持較高的可溶性糖和淀粉含量。而在選育高脂肪含量的花生品種時(shí),淀粉含量極顯著降低。

表3 花生品質(zhì)與條帶缺失間的相關(guān)關(guān)系

注：*和**分別表示相關(guān)性達(dá)1%和5%的顯著水平。

花生蛋白質(zhì)條帶缺失與籽仁品質(zhì)間的關(guān)系因指標(biāo)不同而不同，除蛋白質(zhì)條帶缺失與淀粉含量間呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系外，其余品質(zhì)指標(biāo)與條帶缺失間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且可溶性糖與條帶缺失間的負(fù)相關(guān)關(guān)系達(dá)顯著水平。花生蛋白質(zhì)條帶缺失的品種淀粉含量較低，條帶缺失與淀粉含量間的相關(guān)系數(shù)為0.257 8，達(dá)極顯著水平，其與可溶性糖含量間的相關(guān)系數(shù)為-0.139 7，條帶缺失的品種可溶性淀粉含量相對(duì)較高。

2.5 缺失亞基功能分析

對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及相關(guān)的文獻(xiàn)查詢，共檢測(cè)得到112個(gè)肽段，其中18個(gè)蛋白質(zhì)為可信蛋白(表4)。18個(gè)可信蛋白中的11個(gè)蛋白質(zhì)參與免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，占可信蛋白的61%，4個(gè)蛋白參與氧化作用(22%)，1個(gè)蛋白質(zhì)參與信號(hào)傳遞(6%)，還有2個(gè)蛋白為其他或未知功能蛋白(11%)。

表4 蛋白鑒定結(jié)果和功能分類

3 結(jié)論

脂肪和蛋白質(zhì)是花生的主要營(yíng)養(yǎng)成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為39.56～58.96 g/100 g和22.19～33.19 g/100 g，平均值分別為50.14 g/100 g和27.6 g/100 g?；ㄉ讶手锌扇苄蕴呛偷矸酆科骄捣謩e為9.33 g/100 g和7.37 g/100 g，但其變異系數(shù)較大，分別為13.55和46.96。花生籽仁淀粉含量與蛋白質(zhì)、脂肪和可溶性糖間均表現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，可溶性糖與蛋白質(zhì)含量間呈極顯著的正相關(guān)而脂肪含量與蛋白質(zhì)和可溶性糖含量間均無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系?？扇苄蕴呛偷矸酆渴怯绊懟ㄉ诟械闹匾蛩?，也是判別食用型花生主要指標(biāo)，其含量高低對(duì)食用型花生品種培育與改良具有重要意義。花生以蛋白質(zhì)含量為育種目標(biāo)選育品種,可能保持較高的可溶性糖和淀粉含量，在選育高脂肪含量的花生品種時(shí),淀粉含量極顯著降低。

花生貯藏蛋白共有14～17條條帶，各亞基分子質(zhì)量在14.4～97.4 ku之間，僅有分子質(zhì)量為66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5條帶顏色深、面積大，其含量較高，一些品種在34.2 ku處有明顯的條帶缺失，占供試品種材料總數(shù)的21.7%；在26.8、25.6 ku處或表現(xiàn)條帶缺失或表現(xiàn)明顯的顏色、面積和含量差異。對(duì)缺失蛋白亞基進(jìn)行SHOTGUN測(cè)試，共檢測(cè)得到112個(gè)肽段，其中18個(gè)蛋白質(zhì)為可信蛋白，其功能涉及生物細(xì)胞代謝/能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞等細(xì)胞過(guò)程。缺失蛋白涉及花生各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，可能與花生生物產(chǎn)量的提高和品質(zhì)的改善有密切關(guān)系。因此，篩選、培育優(yōu)良花生特定亞基缺失品種，深入研究花生蛋白組分及其不同亞基蛋白組的形成規(guī)律以及其營(yíng)養(yǎng)和功能特性，可為表征花生品種的優(yōu)劣、優(yōu)良品種篩選、優(yōu)質(zhì)花生蛋白資源的開發(fā)，以及花生食品工業(yè)的發(fā)展提供參考。

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