藏柴胡以及種植北柴胡和竹葉柴胡的皂苷含量研究

郭佳琪，楊印軍，方偉，郭寶林

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部規(guī)定柴胡藥材來(lái)源于北柴胡BupleurumchineseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的根。然而，20世紀(jì)80年代以前柴胡來(lái)源于野生，后因資源不足，各地進(jìn)行了引種和栽培，目前栽培藥材已經(jīng)成為主流。作者在2013年和2015年兩次對(duì)甘肅、山西、陜西、河北等柴胡種植主產(chǎn)地進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)早期引種于當(dāng)?shù)匾吧髁魑锓N，但由于植物、藥材和種子較難鑒別，以及種子價(jià)格和種植產(chǎn)量不同，以柴胡皂苷含量為主導(dǎo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等多因素影響，柴胡藥材的資源構(gòu)成隨時(shí)間而變化，現(xiàn)在市場(chǎng)的栽培柴胡主流藥材是3個(gè)，分別為北柴胡、竹葉柴胡(又稱膜緣柴胡)B.marginatumWall.ex DC.和藏柴胡(為市場(chǎng)俗稱，植物來(lái)源為窄竹葉柴胡B.marginatumWall.ex DC.var.stenophyllum(Wolff)Shan et Y.Li)。藏柴胡最早引種自西藏，因產(chǎn)量高和柴胡皂苷含量高，在甘肅渭源、臨洮、康樂(lè)等地大量種植，并逐漸輻射到山西、青海等省區(qū)(藥材形態(tài)以根較長(zhǎng)，柔軟，斷面韌皮部比例高為特點(diǎn))，市場(chǎng)上還有來(lái)源于西藏和青海的野生資源，本研究組曾針對(duì)藏柴胡進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的化學(xué)研究[1-2]；竹葉柴胡在甘肅廣為栽培(也有人認(rèn)為是銀州柴胡B.yinchowenseShan et Y.Li[3]，藥材形態(tài)以根少分枝，木質(zhì)部寬而柴性強(qiáng)，莖殘基密集葉鞘痕為特點(diǎn))，且因?yàn)榉N子產(chǎn)量高、播種后萌發(fā)率高等優(yōu)勢(shì)，被山西、陜西、河北等原北柴胡主產(chǎn)區(qū)引入種植，市場(chǎng)占比在不斷升高。本文收集了當(dāng)前3種藥材主產(chǎn)地的樣品，研究其中總皂苷和柴胡皂苷a、d的含量，以進(jìn)行比較。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

藥材來(lái)源信息見(jiàn)表4，均于2016年上半年收集，為2015年產(chǎn)藥材，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員對(duì)藥材性狀進(jìn)行鑒別。共33批，其中藏柴胡16份，包括種植和野生來(lái)源，種植北柴胡10份，種植竹葉柴胡7份，均去掉殘留地上莖，粉粹，過(guò)四號(hào)篩。

1.2 儀器及試劑

GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，BP 211D十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Satorius公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，Waters 2695高效液相色譜儀(Empower工作站)配置Waters 2478 DAD檢測(cè)器，EYELAOSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，unico UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

柴胡皂苷a(批號(hào)16060105)、柴胡皂苷d(批號(hào)16060106)對(duì)照品均購(gòu)于成都曼斯特生物技術(shù)有限公司，面積歸一化法測(cè)定純度均>98%。Fisher乙腈(色譜純)，蒸餾水購(gòu)于廣州屈臣氏有限公司，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷含量測(cè)定[4]

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柴胡皂苷a 12.68 mg的標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，配成2.536 mg·mL-1備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取柴胡樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨-甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃水溫超聲處理30 min(100 W)，濾過(guò)，用甲醇20 mL分兩次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 最佳測(cè)定波長(zhǎng)選擇 取對(duì)照品溶液200 μL，在樣品中加入濃度1%的對(duì)二甲氨基苯甲醛的乙醇溶液，在70 ℃的水浴中反應(yīng)10 min，放置室溫，再加入磷酸4 mL，并在70 ℃的水浴中反應(yīng)30 min，放置室溫后，以空白溶媒作為空白校正，進(jìn)行掃描(400～600 nm)。結(jié)果在547 nm左右有最大吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為547 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取對(duì)照品母液10 μL、25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL、1000 μL定容至2 mL容量瓶中，按“2.1.3”方法處理，于547 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以柴胡皂苷a的濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1.155 8x-0.032 8，r=0.999 8。結(jié)果顯示，柴胡皂苷a在0.063 4～2.536 mg·mL-1的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一份柴胡皂苷供試品溶液(SX-BC-07)，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份柴胡樣品(SX-BC-07)粉末0.5 g，平行6份。按照“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液并按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作方法測(cè)定吸光度，計(jì)算得R為2.79%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取柴胡(SX-BC-07)供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法于配制后0、1、2、3、4、5 h測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為0.88%，結(jié)果表明供試品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取柴胡(SX-BC-07)粉末0.25 g，精密稱定。加入對(duì)照品柴胡皂苷a適量，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液并按照“2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，測(cè)得平均加樣回收率為102.24%，RSD為2.24%，表明總皂苷回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.9樣品的含量測(cè)定 分別取33個(gè)樣品粉末0.5 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液并按照“2.1.3”項(xiàng)下測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 柴胡總皂苷加樣回收實(shí)驗(yàn)

注：加入成分為柴胡皂苷a

2.2 柴胡皂苷a、d的含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取柴胡皂苷a、d的對(duì)照品(精密稱定)，加入5%濃氨-甲醇溶液制成每1 mL含柴胡皂苷a 4.8 mg，柴胡皂苷d 5.4 mg的溶液，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。

2.2.2 供試品溶液制備 按照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法，蒸干溶劑后，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 采用Agela ODS-2色譜柱(5 μm，4.6×250 mm)、乙腈-水(A-B)為流動(dòng)相；梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。柱溫為室溫，進(jìn)樣10 μL。梯度洗脫條件：0～23 min，75%～45%A；23～25 min，45%～75%A；25～35 min，75%A。色譜圖如圖1所示：

圖1 混合對(duì)照品和柴胡樣品(SX-BC-03)的HPLC圖

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系 將對(duì)照品母液對(duì)半稀釋得各系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按照“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣10 μL測(cè)定，以峰面積(Y)和對(duì)照品濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得各對(duì)照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以信噪比S/N=3為基準(zhǔn)，測(cè)得最低檢測(cè)限，以信噪比S/N=10為基準(zhǔn)，測(cè)得最小定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 柴胡皂苷a、d的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和定量限

2.2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.30 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、1.20 mg·mL-1的3種濃度的對(duì)照品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對(duì)照品柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面積 RSD分別為1.24%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末(ZC-09)6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜方法測(cè)定，計(jì)算樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為0.85%、0.49%，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一份供試品溶液(BC-03)，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD值分別為1.01%、2.42%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的供試品粉末(SX-BC-03)6份，每份各約 0.25 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞三角瓶中，分別精密加入含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d濃度為1.30 mg·mL-1、2.14 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備，按“2.2.3”項(xiàng)下的色譜方法測(cè)定，測(cè)得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均回收率分別為100.87%，100.96%，RSD值分別為1.78%，3.01%，表明該方法的準(zhǔn)確性良好。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 柴胡皂苷a、d加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.3 樣品的含量測(cè)定

樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 柴胡樣品信息以及柴胡皂苷含量測(cè)定結(jié)果(%)

4 討論

柴胡含有的皂苷類成分在柴胡屬大多數(shù)種類中都以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為主[5]，因此《中華人民共和國(guó)藥典》和日本藥局方(來(lái)源于三島柴胡B.falcatum)均用柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總量作為柴胡的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。從本文的研究結(jié)果看，a+d總量，種植北柴胡為0.46%～1.28%，甘肅種植竹葉柴胡為0.88%～1.90%，均高于或者較大幅度高于的《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)規(guī)定的不低于0.3%的標(biāo)準(zhǔn)，這也是竹葉柴胡一直在市場(chǎng)流行，被市場(chǎng)接納和廣泛應(yīng)用的原因之一。由于北柴胡和竹葉柴胡的種植產(chǎn)量大約在50～70 kg，產(chǎn)量較低，因此市場(chǎng)藥材常保留較長(zhǎng)一段莖，影響了皂苷的含量，也是近年來(lái)市場(chǎng)柴胡檢驗(yàn)不合格的主要原因之一。藏柴胡的a+d總量為2.03%～3.95%(野生和種植之間差異不明顯)，大約是北柴胡含量的3～4倍，藏柴胡的種植產(chǎn)量達(dá)200 kg以上，藥材形態(tài)和其他柴胡差異較大(根長(zhǎng)、柔軟、皮部比例大)，易于辨認(rèn)，各地種植面積仍舊在擴(kuò)大中，本研究組調(diào)查獲知2016年種植面積不少于2000 hm2?；诓窈碥毡旧硪彩嵌拘猿煞諿6]，本研究組的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，相同生藥量北柴胡未呈現(xiàn)毒性，而服用藏柴胡的小鼠具有明顯的中毒癥狀(未發(fā)表)，因此藏柴胡的使用應(yīng)該慎重。

竹葉柴胡為四川等地方標(biāo)準(zhǔn)收載，雖然皂苷含量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，但不應(yīng)在全國(guó)流通，現(xiàn)在已經(jīng)成為柴胡藥材主流來(lái)源，應(yīng)盡快進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。

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