美洲大蠊的含氮成分及其促創(chuàng)面愈合相關(guān)活性研究△

王心龍，向斌，李亞美，秦付營(yíng)，耿福能，晏永明，程永現(xiàn)，*

(1.中國(guó)科學(xué)院 昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610000；3.深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院，廣東 深圳 518060)

美洲大蠊Periplanetaamericana系節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科(Blattidae)大蠊屬(Peripalneta)昆蟲(chóng)，俗稱(chēng)“蟑螂“。蟑螂在地球上已經(jīng)存在億年，是世界上生命力最強(qiáng)、至今繁衍最成功的昆蟲(chóng)類(lèi)群之一[1]。它是傳播疾病和誘發(fā)過(guò)敏性疾病的害蟲(chóng)，同時(shí)也是中國(guó)傳統(tǒng)的蟲(chóng)類(lèi)中藥，具有悠久的入藥歷史。其最早見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，可用于治療血瘀證、寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無(wú)子[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明美洲大蠊提取物具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗腫瘤、抗菌、抗炎等多方面藥理作用[3-6]。迄今，以美洲大蠊藥材為原料開(kāi)發(fā)的藥物有康復(fù)新液、心脈隆、肝龍膠囊等。美洲大蠊中的化學(xué)成分主要有信息素、氨基酸、昆神經(jīng)肽、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、油脂、核酸類(lèi)、異黃酮等[7]。鑒于康復(fù)新液是以水為溶媒的液體制劑在臨床使用，而美洲大蠊是其主要唯一組成藥味，因此，我們對(duì)美洲大蠊的水溶性化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離并鑒定了16個(gè)化合物，其中化合物1、3、5和6是新的天然產(chǎn)物，而化合物2、4、7、10～16是首次從美洲大蠊中分離得到。

1 儀器與材料

1.1 儀器

薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠(chǎng))；MCI gel CHP 20P(75～150 μm，日本三菱公司產(chǎn)品)；Sephadex LH-20(25～100 μm，Pharmacia公司)；RP-18(40～63 μm，日本Daiso)；北京創(chuàng)新通恒LC3000型HPLC和Agilent 1200型HPLC，半制備色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×9.4 mm，5 μm)和YMC-Pack-ODS-A(250 mm×10 mm，5 μm)。Bruker Avance Ⅲ 400 MHz、500 MHz和Bruker Avance 600 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；Waters Autospec Premier P776質(zhì)譜儀器。

1.2 材料

美洲大蠊提取物于2015年9月由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，美洲大蠊系該公司養(yǎng)殖。

Griess Reagent、LPS(lipopolysaccharide)及對(duì)照藥物L(fēng)-NMMA(NG-monomethyl-L-arginine, monoacetate salt)購(gòu)自Sigma公司；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；人皮膚成纖維細(xì)胞[HDFs，美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)]；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs，深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部)，由劉寶華教授研究組饋贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(BI公司，用于抗一氧化氮生成活性實(shí)驗(yàn))；Matrigel膠(Corning公司)。

2 方法

2.1 提取與分離

取美洲大蠊干燥蟲(chóng)體25 kg，經(jīng)粉碎后，熱水回流提取(3×2 h)，提取液減壓濃縮得到總提物(約2 kg)?？偺嵛锝?jīng)反相色譜MCI gel CHP 20P 柱(甲醇-水，0%～100%)梯度洗脫得11個(gè)組分(F1～F11)。F8(180 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)得3個(gè)組分(F8.1～F8.3)。F8.2(110 g)經(jīng)MCI gel CHP 20P色譜柱(甲醇-水，10%～100%)梯度洗脫得8個(gè)組分(F8.2.1～F8.2.8)。F8.2.3(2.1 g)經(jīng)RP-18柱(甲醇-水，5%～15%)得4個(gè)組分(F8.2.3.1～F8.2.3.4)。F8.2.3.2(120 mg)經(jīng)制備HPLC(甲醇-水，12%)得化合物6(63.0 mg，tR=10.5 min)。F8.2.3.3(350 mg)經(jīng)制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，4∶1)和半制備HPLC(甲醇-水，13%)得化合物9(13.2 mg，tR=14.7 min)和15(8.9 mg，tR=17.7 min)。F8.2.4(2.9 g)經(jīng)RP-18柱(甲醇-水，5%～20%)得6個(gè)組分(F8.2.4.1～F8.2.4.6)。F8.2.4.3(980 mg)經(jīng)制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，4∶1)和制備HPLC(甲醇-水，10%)得化合物2(23.5 mg，tR=15.3 min)和3(17.3 mg，tR=17.4 min)。F8.2.4.5(860 mg)經(jīng)制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，4∶1)和半制備HPLC(甲醇-水，10%)得化合物4(9.2 mg，tR=7.7 min)和5(8.1 mg，tR=10.7 min)。F8.2.6(4.2 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇-水，80%)得4個(gè)組分(F8.2.6.1～F8.2.6.4)。F8.2.6.2(650 mg)經(jīng)制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，4∶1)和半制備HPLC(甲醇-水，8%)得化合物1(5.2 mg，tR=13.4 min)。F8.2.6.3(1.1 g)經(jīng)制備HPLC(甲醇-水，15%)和半制備HPLC(甲醇-水，10%)得化合物16(5.7 mg，tR=16.3 min)。F9(56 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇-水，80%)和RP-18色譜柱(甲醇-水，10%～25%)梯度洗脫得7個(gè)組分(F9.1～F9.7)。F9.2(1.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇-水，70%)，制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，5∶1)和半制備HPLC(甲醇-水，15%)得化合物7(9.7 mg，tR=10.3 min)和14(13.5 mg，tR=12.3 min)。F9.3(2.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18色譜柱(甲醇-水，15%～25%)、制備薄層色譜(三氯甲烷-甲醇，4∶1)和半制備HPLC(甲醇-水，15%)得化合物8(4.7 mg，tR=13.3 min)。F10(10 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇-水，80%)和RP-18色譜柱(甲醇-水，10%～25%梯度洗脫)得8個(gè)組分(F10.1～F10.8)。F10.4(1.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇-水，80%)、半制備HPLC(甲醇-水，15%)得化合物10(9.7 mg，tR=10.3 min)、11(9.7 mg，tR=10.3 min)和13(13.5 mg，tR=12.3 min)。F10.5(0.6 g)經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)、RP-18色譜柱(甲醇-水，15%～55%)、半制備HPLC(甲醇-水，15%)得化合物12(4.7 mg，tR=13.3 min)。

2.2 抗一氧化氮(NO)生成活性測(cè)試

具體實(shí)驗(yàn)方法按照以前文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[8]。

2.3 促人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)增殖活性測(cè)試

將對(duì)數(shù)期HDFs細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液濃度約為3×104·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 mL，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的化合物溶液培養(yǎng)100 mL，空白對(duì)照組加入等量的新鮮培養(yǎng)基。各組設(shè)置3個(gè)平行孔，置于培養(yǎng)箱中孵育48 h后，每孔加入20 mL的5 mg·mL-1MTT溶液，置于37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h，終止培養(yǎng)，除去上清液，每孔加入150 mL DMSO，振蕩15 min，待藍(lán)紫色結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，每組取平均值，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，按公式(1)計(jì)算。

(1)

2.4 促人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)血管生成活性測(cè)試

將Matrigel膠均勻鋪于預(yù)冷的96孔板中，每孔50 μL，37 ℃孵育40 min，待Matrigel膠凝固后，每孔加入1×104HUVECs細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入待測(cè)化合物(終濃度20 μmol·L-1)處理，對(duì)照組不含藥物。具體實(shí)驗(yàn)方法按照以前文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行[8]。

2.5 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)遷移實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)期HUVECs細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔14×104個(gè)細(xì)胞。置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，用1×PBS清洗3次，然后用含0.5% FBS的M199培養(yǎng)基饑餓6 h。饑餓結(jié)束后，用P10槍頭進(jìn)行劃痕，實(shí)驗(yàn)組加入溶有不同藥物的M199培養(yǎng)基，空白組加入新鮮的M199培養(yǎng)基，并進(jìn)行拍照。在37 ℃、5% CO2條件下孵育6 h后，用1×PBS清洗3次，加入新鮮的M199培養(yǎng)基，并進(jìn)行拍照。劃痕面積用Image pro plus 6按公式(2)計(jì)算。

遷移面積(%)=[(實(shí)驗(yàn)組0 h劃痕面積-實(shí)驗(yàn)組6 h劃痕面積)/(空白對(duì)照組0 h劃痕面積-空白組6 h劃痕面積)]×100%

(2)

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色固體，EI-MSm/z：170(78)[M]+，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.53(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，8.51(1H，s，H-3)，8.43(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，3.76(1H，m，H-8)，3.57(1H，d，J=7.1 Hz，H-7)，3.08(1H，dd，J=13.8，3.0 Hz，Ha-9)，2.75(1H，dd，J=13.8，9.6 Hz，Hb-9)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：156.6(C-2)，146.0(C-3)，144.3(C-5)，142.4(C-6)，75.4(C-7)，71.7(C-8)，63.6(C-9)。參考文獻(xiàn)[9]解析并確定化合物1為2-(1，2，3-三羥基丙基)吡嗪，檢索發(fā)現(xiàn)其為1個(gè)新的天然產(chǎn)物，并對(duì)其核磁共振數(shù)據(jù)進(jìn)行了首次歸屬。

化合物2：白色固體，EI-MSm/z：198(28)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.34(1H，s，H-5)，8.32(1H，s，H-3)，3.94(1H，m，H-8)，3.77(1H，dd，J=11.4，3.9 Hz，Ha-10)，3.61(1H，dd，J=11.4，6.4 Hz，Hb-10)，3.54(1H，m，H-9)，3.17(1H，dd，J=14.1，3.1 Hz，Ha-7)，2.86(1H，dd，J=14.1，9.5 Hz，Hb-7)，2.53(3H，s，2-CH3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：156.2(C-6)，154.7(C-2)，143.3(C-5)，142.7(C-3)，76.2(C-3′)，73.0(C-2′)，64.6(C-4′)，39.6(C-1′)，21.3(2-CH3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[10]，故確定化合物2為2-甲基-6-(2，3，4-三羥基丁基)吡嗪。

化合物3：白色固體，EI-MSm/z：198(15)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.47(1H，s，H-2)，8.44(1H，s，H-5)，3.94(1H，m，H-8)，3.79(1H，dd，J=11.2，3.8 Hz，Ha-10)，3.63(1H，dd，J=11.2，6.3 Hz，Hb-10)，3.55(1H，m，H-9)，3.20(1H，dd，J=14.1，3.1 Hz，Ha-7)，2.89(1H，dd，J=14.1，9.4 Hz，Hb-7)，2.54(3H，s，3-CH3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：153.9(C-6)，152.5(C-3)，145.4(C-5)，144.8(C-2)，76.2(C-9)，73.0(C-2′)，64.6(C-10)，39.2(C-7)，20.7(3-CH3)。參考文獻(xiàn)[9-10]將化合物3解析并確定為3-甲基-6-(2，3，4-三羥基丁基)吡嗪，其為1個(gè)新的天然產(chǎn)物，我們并對(duì)其核磁共振數(shù)據(jù)進(jìn)行了首次歸屬。

化合物4：白色固體，EI-MSm/z：95(22)[M]+，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.20(1H，dd，J=8.4，4.5 Hz，H-5)，8.12(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，8.01(1H，brd，J=4.5 Hz，H-6)，7.14(1H，brd，J=8.4 Hz，H-4)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：153.9(C-3)，140.1(C-6)，138.1(C-2)，124.1(C-5)，122.0(C-4)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[11]，故確定化合物4為3-羥基吡啶。

化合物5：白色固體，EI-MSm/z：169(31)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.44(1H，s，H-9)，7.03(1H，d，J=4.0 Hz，H-3)，6.30(1H，d，J=4，0 Hz，H-4)，4.69(2H，s，H-6)，4.50(2H，t，J=4.5 Hz，H-8)，3.83(2H，t，J=4.5 Hz，H-7)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：179.7(C-9)，144.0(C-5)，132.1(C-2)，125.1(C-3)，110.0(C-4)，61.4(C-8)，55.1(C-6)，47.6(C-7)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[12]，故確定化合物5為1-(2-羥乙基)-5-羥甲基-1H-吡咯-2-醛。

化合物6：白色固體，EI-MSm/z：166(100)[M]+，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：10.24(1H，s，NH-6)，8.18(1H，s，H-2)，7.19(1H，s，H-4)，2.40(1H，s，H-10)，2.03(1H，s，H-8)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：186.1(C-9)，167.8(C-7)，149.8(C-5)，135.3(C-2)，127.1(C-4)，111.1(C-3)，25.9(C-10)，22.8(C-8)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[13]，故確定化合物6為N-(5-乙酰吡咯-3-基)乙酰胺。

化合物7：棕色固體，ESI-MS：m/z162 [M+H]+；1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.94(1H，d，J=8.0 Hz，H-2)，7.71(1H，d，J=8，0 Hz，H-5)，7.25(1H，t，J=8.0 Hz，H-6)，7.12(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，6.36(1H，d，J=8.0 Hz，H-3)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[14]，故確定化合物7為8-羥基-2，3-二氫-4(1H)-喹諾酮。

化合物8：黃色固體，EI-MSm/z：85(38)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.27(2H，t，J=5.6 Hz，H-5)，2.30(2H，t，J=6.4 Hz，H-3)，1.78(2H，m，H-4)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[15]，故確定化合物8為戊內(nèi)酰胺。

化合物9：棕色固體，EI-MSm/z：195(9)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.46(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.42(1H，brs，H-2)，6.29(1H，dd，J=8，0，2.1 Hz，H-6)，3.09(2H，t，J=7.4 Hz，H-8)，2.39(2H，t，J=7.4 Hz，H-7)，1.68(1H，s，H-11)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：171.9(C-10)，144.8(C-3)，143.3(C-4)，130.7(C-1)，119.7(C-6)，115.5(C-2)，115.0(C-5)，41.0(C-8)，34.4(C-7)，21.2(C-11)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[16]，故確定化合物9為N-乙酰多巴胺。

化合物10：淡黃色固體，ESI-MSm/z：192 [M+H]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.09(1H，s，H-4)，2.48(3H，s，H-6)，7.06(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.81(1H，d，J=8.4 Hz，H-11)，7.01(1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-12)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：153.6(C-2)，120.0(C-4)，162.0(C-5)，13.7(C-6)，121.2(C-7)，112.4(C-8)，146.9(C-9)，147.4(C-10)，116.8(C-11)，117.3(C-12)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17]，故確定化合物10為aspongopusin。

化合物11：淡黃色固體，EI-MSm/z：175(22)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：8.22(1H，dd，J=6.4，2.1 Hz，H-5)，8.20(1H，s，H-2)，7.45(1H，dd，J=6.5，1.9 Hz，H-8)，7.22(2H，overlap，H-6，7)，4.73(1H，s，H-11)；13C-NMR(150 MHz，CD3OD)δ：195.9(C-10)，138.2(C-9)，134.0(C-2)，126.9(C-4)，124.4(C-7)，123.3(C-6)，122.7(C-5)，114.9(C-3)，112.9(C-8)，66.3(C-11)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[18]，故確定化合物11為deoxyhyrtiosine A。

化合物12：白色固體，EI-MSm/z：242(22)[M]+，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：11.80(1H，s，NH-3)，11.70(1H，s，NH-1)，7.92(1H，s，H-6)，7.71(1H，s，H-9)，2.49(3H，s，H-12)，2.46(3H，s，H-11)；13C-NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：160.6(C-4)，150.1(C-2)，146.5(C-10a)，144.6(C-7)，141.6(C-9a)，138.9(C-8)，138.3(C-5a)，130.2(C-4a)，128.7(C-6)，125.8(C-9)，20.2(C-12)，19.6(C-11)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[19]，故確定化合物12為光色素。

化合物13：淡黃色固體，EI-MSm/z：125(5)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.99(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.33(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)，7.21(1H，dd，J=6.0，2.0 Hz，H-4)，4.57(2H，s，6-CH2).13C-NMR(125 MHz，CD3OD)δ：155.9(C-6)，151.5(C-3)，137.7(C-2)，125.3(C-5)，123.4(C-4)，65.2(6-CH2)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[20]，故確定化合物13為6-羥甲基-3-羥基吡啶。

化合物14：白色固體，EI-MSm/z：170(27)[M]+，1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.73(1H，d，J=2.0 Hz，H-3)，6.65(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.55(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-5)，4.35(1H，t，J=6.0 Hz，H-7)，3.34(2H，d，J=6.0 Hz，H-8)；13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：144.8(C-1)，144.1(C-2)，134.4(C-4)，117.1(C-5)，115.0(C-6)，113.8(C-3)，73.7(C-7)，67.7(C-8)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[21]，故確定化合物14為3，4-二羥基苯基甘油。

化合物15：棕色固體，ESI-MSm/z：165 [M+H]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.82(1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-3)，7.26(1H，td，J=8.0，2.0 Hz，H-5)，6.77(2H，overlap，H-4，6)，2.94(2H，m，H-7)，1.66(1H，m，H-9)，1.54(2H，m，H-8)，0.94(6H，d，J=6.0 Hz，H-10，11)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：162.6(C-1)，133.9(C-3)，131.6(C-5)，119.8(C-2)，119.0(C-4)，117.2(C-6)，39.1(C-7)，37.3(C-8)，26.8(C-9)，22.5(C-10，11)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[22]，故確定化合物15為2-異戊基苯酚[2-(isopentyl)phenol]。

化合物16：黃色固體，EI-MSm/z：126(8)[M]+，1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.36(1H，s，H-1)，6.96(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，6.25(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，4.60(3H，s，H-6)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[23]，故確定化合物16為5-羥甲基呋喃-2-醛。

3.2 活性測(cè)試

康復(fù)新液主要用于創(chuàng)傷修復(fù)，創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程始終與炎癥伴隨，NO是重要的氣體信號(hào)分子，具有多種生理作用，病理狀態(tài)下其與炎癥相關(guān)。美洲大蠊是市場(chǎng)上中成藥康復(fù)新液的唯一中藥來(lái)源，為此采用NO為指標(biāo)，檢測(cè)了美洲大蠊中化合物對(duì)其的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，化合物9和14顯示了顯著的抑制NO生成活性，其抑制率分別為32.59%和28.51%。

表1 化合物抗NO生成抑制試驗(yàn)

肉芽組織形成與成纖維細(xì)胞關(guān)系密切，因此，我們對(duì)除化合物10以外的全部化合物進(jìn)行了促人皮膚成纖維細(xì)胞(HDFs)增殖活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，化合物2、6、7、9、12和16在20 μmol·L-1時(shí)均可顯著抑制HDFs增殖，尤以6、9和12作用最為顯著。一般而言，肉芽組織的形成與成纖維細(xì)胞的增殖有關(guān)，而此類(lèi)化合物均呈現(xiàn)了增殖抑制相反的作用，一方面表明整體呈現(xiàn)出對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)有促進(jìn)作用的美洲大蠊中存在雙向調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時(shí)也提示此類(lèi)化合物可能與抑制疤痕形成、抗纖維化有關(guān)，但均待進(jìn)一步研究。

創(chuàng)傷修復(fù)的后期是組織重建，該過(guò)程涉及血管生成，而HUVECs的激活、增殖、遷移、成管等是篩選抗/促血管生成的重要模型，因此我們利用HUVECs對(duì)化合物進(jìn)行了促血管生成活性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖2?；衔?2、13和14均可顯著促進(jìn)HUVECs遷移，尤以化合物13作用最為明顯，提示其促血管生成作用。另外，值得注意的是在成管實(shí)驗(yàn)中，僅有化合物3在20 μmol·L-1時(shí)顯示了促進(jìn)HUVECs成管活性。見(jiàn)圖3。

注：One-way ANOVA，與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同。圖1 化合物促HDFs增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖2 化合物促HUVECs遷移活性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖3 化合物促進(jìn) HUVECs血管生成活性試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

4 結(jié)論與討論

美洲大蠊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究長(zhǎng)期以來(lái)進(jìn)展不大，我們本次報(bào)道分離得到的16個(gè)非肽類(lèi)小分子化合物，其中化合物1、3、5和6為新的天然產(chǎn)物，化合物2、4、7、10～16為首次從美洲大蠊中分離得到，其為認(rèn)識(shí)美洲大蠊昆蟲(chóng)化學(xué)提供了新的研究資料。與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的活性研究發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的化合物分別在抗炎、促血管生成等方面表現(xiàn)出作用，提示美洲大蠊治療創(chuàng)面修復(fù)的物質(zhì)具有多樣性。另外成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)促增殖化合物，反而部分化合物具有增殖抑制作用，表明美洲大蠊中可能還存在拮抗創(chuàng)面修復(fù)的活性物質(zhì)或具有抗纖維化的有效物質(zhì)。該研究為支持康復(fù)新液臨床愈創(chuàng)療效提供了新的佐證。

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