藻際芽孢桿菌對壇紫菜生理的影響

熊玉琴， 楊 銳， 楊華田， 孫曉曉

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 浙江省海洋生物工程重點實驗室， 寧波 315211)

藻類是海洋生態(tài)系統(tǒng)中重要的生產(chǎn)者，它們在生長過程中向環(huán)境釋放大量有機(jī)質(zhì)，并在特定條件下分泌維生素、酶和毒素，在藻體周圍形成一種獨特的微環(huán)境，被定義為“藻際微環(huán)境”(Phycosphere)[1]。細(xì)菌是海洋環(huán)境重要的分解者，通過一系列的代謝活動參與藻際微環(huán)境中多種物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化過程，是藻類營養(yǎng)物質(zhì)的提供者與加工者；同時細(xì)菌還通過產(chǎn)生或分泌對藻類有益的代謝物質(zhì)或胞外物，從而促進(jìn)藻類的生長[2]，影響著藻類的種類和生理狀態(tài)[3]。

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)[4]是產(chǎn)量最高的紫菜栽培種，具有較高的營養(yǎng)、藥用及生態(tài)價值，已經(jīng)成為最有價值的人工栽培海藻之一。近年來，由于紫菜人工栽培范圍的不斷擴(kuò)大，工業(yè)發(fā)展以及氣候變化等因素的影響，海區(qū)環(huán)境日益惡化，每年都有不同程度的紫菜病害發(fā)生。紫菜病爛是一個相當(dāng)復(fù)雜的問題，許多專家從引起紫菜病爛的病原菌入手，如引起條斑紫菜絲狀體黃斑病的河豚毒素交替假單胞菌[5]、條斑紫菜綠變病檸檬假交替單胞菌及壇紫菜葉狀體紅爛病的細(xì)菌[6-7]等。雖然發(fā)現(xiàn)了病害的單一致病菌，但無法確定所識別的致病菌是否為唯一的病原菌，而且無法明確同屬不同種間是否表現(xiàn)出致病性與益生性的差異[8]。這說明藻際微生物的功能可能受到其他因素的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對藻類產(chǎn)生影響。因此，近期研究開始關(guān)注藻際微環(huán)境與藻類的生態(tài)關(guān)系，為探索藻類健康養(yǎng)殖提供了新視角。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

Zobell 2216E 海水培養(yǎng)基：酵母粉1 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鐵0.1 g，陳海水定容至1000 mL(pH 7.6～7.8)；營養(yǎng)海水：參考文獻(xiàn)[9]的方法。

壇紫菜采集于寧波象山，自然陰干，儲存于-20℃。在無菌海水中復(fù)蘇24 h，挑選細(xì)長、顏色呈褐色的葉片，在無菌海水中用滅菌軟毛刷清洗其表面3次，將清洗好的紫菜葉片放入0.7%KI溶液中浸泡10 min，經(jīng)無菌海水清洗3遍后，抗生素處理參考文獻(xiàn)[10]的方法。

芽孢桿菌Bacillμssp. WPySW2由本實驗室提供。WPySW2接種于100 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，37℃、140 r/min 下活化2～3次。稀釋濃度為1×108cells/mL，低速離心去掉營養(yǎng)海水，無菌海水懸浮，按1∶100比例接入營養(yǎng)海水中。

1.2方法

1.2.1 “藻-菌”共培養(yǎng)與純培養(yǎng)

每個平行含 0.2 g 無菌處理好的葉狀體，加入到300 mL海水營養(yǎng)液，進(jìn)行壇紫菜葉狀體與芽孢桿菌(3×108cells/mL)共培養(yǎng)(Ph-B)，光強(qiáng)：50～70 μmoL·photons/m2s1，光周期(L∶D)= 12∶12，溫度為20℃，培養(yǎng)周期3 d，充氣。相同培養(yǎng)條件下，純培養(yǎng)(Ph-C)則不添加細(xì)菌。

1.2.2 芽孢桿菌定植壇紫菜的生物特性觀察

樣品預(yù)處理：將培養(yǎng)3 d的壇紫菜取出，剪成約1～2 mm的正方形，若干片，用現(xiàn)配置的2.5%戊二醛固定后投射電鏡觀察。

1.2.3 酶活測定

SOD和POD酶液制備：取0.3 g 新鮮藻體，加入0.1 mo/L pH 7.4 PBS 緩沖液，制備成10%勻漿液，然后在4℃下4000 r/min離心10 min，上清即用于酶活力測定。SOD和POD、使用試劑盒(南京建成)測定。

1.2.4 光合色素測定

藻膽蛋白(Phy)含量測定參考高洪峰[11]的方法，略有改動。精確稱取0.02 g 藻體3份，液氮研磨，加入2 mL PBS 緩沖液，放入冰箱冷凍(-20℃)，室溫解后離心(12 000 r/min，4℃)20 min，上清即為藻膽蛋白粗提液，分別于565、615、650 nm波長下測定其OD值。計算公式為：

CRPE=0.123A565-0.068A615+0.015A650

(1)

CRPC=0.162A615-0.001A565-0.098A650

(2)

CAPC=0.171A650-0.006A565-0.004A615

(3)

式中，CRPE、CRPC、CAPC分別為R—藻紅蛋白、R—藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白的含量。

葉綠素a：測定參考文獻(xiàn)[9]的方法。

公式：Ca=13.95OD665-6.88OD649，Ca—葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.5 可溶性蛋白測定

可溶性蛋白含量測定參考文獻(xiàn)[12]的方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣測定，略有改動。精確稱0.1 g鮮藻，加入1 mL緩沖液，冰上機(jī)械勻漿，4000 r/min，離心10 min (4℃)，上清即為待測蛋白溶液。

公式：樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[μg/g(FW)]=(C×V)/W，C—查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得樣品測定管中蛋白質(zhì)的濃度(μg/mL)，V—樣品提取液的總體積，W—樣品鮮重。

1.2.6 游離脯氨酸含量的測定

游離脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮方法測定，參考文獻(xiàn)[13]的方法，略有改動。取新鮮藻體吸干表面水分，稱0.1 g，液氮研磨，加入5 mL 3%磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，5000 r/min，離心10 min，取上清液用于脯氨酸測定。

1.2.7 丙二醛(MDA)含量的測定

采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。0.1 g鮮藻，加入5 mL PBS磨成勻漿液，轉(zhuǎn)移至10 mL試管中，加入5 mL含有0.5%硫代巴比妥酸的10%三氯乙酸，混合液在沸水中加熱10 min，冷去后離心，10 000 r/min，20℃，離心10 min，收集上清，分別測定450、532和600 nm測定吸光值。

公式：MDA [μmoL/g(FW)]=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]×Vt/(1000×FW)，Vt—上清體積，F(xiàn)W—樣品鮮重。

1.2.8 統(tǒng)計分析

各實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Excel 2003、Spass 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，P<0.05 表示顯著性差異，P<0.01表示極顯著性差異。

2結(jié)果與分析

壇紫菜培養(yǎng)至第3天，Ph-C組的壇紫菜葉片細(xì)胞的色素體層和線粒體等結(jié)構(gòu)受到了一定程度的損壞，在細(xì)胞內(nèi)形成了一些空泡(圖1-a)，說明在無菌培養(yǎng)的條件下，壇紫菜生長狀態(tài)受到了影響。在Ph-B組，細(xì)菌聚集在紫菜邊緣，且壇紫菜色素體層和線粒體的結(jié)構(gòu)完整，無明顯空泡的出現(xiàn)，藻體細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量較多(圖1-b)，細(xì)胞代謝旺盛，處于良好的生長狀態(tài)。

如圖2-a所示，隨著培養(yǎng)時間延長，Ph-B組和Ph-C組的POD活性呈先下降后上升的循環(huán)趨勢，兩組壇紫菜POD活性在12 h和48 h達(dá)到最高，分別為18.16 U/mg和17.38 U/mg。純培養(yǎng)組POD活性在6 h達(dá)到最低為9.33 U/mg，共養(yǎng)組POD活性則在72 h達(dá)到最低為10.13 U/mg。兩組壇紫菜葉狀體POD活性在72 h之內(nèi)無顯著性差異(P>0.05)。如圖2-b所示，共養(yǎng)組SOD活性呈逐漸下降的趨勢，對照組則呈下降后又上升，其后逐漸下降的走勢，共養(yǎng)組和對照組在6 h有顯著性差異(P<0.05)，其余時間點兩組沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖1 壇紫菜的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)(a：Ph-C; b：Ph-B)

圖2 芽孢桿菌對壇紫菜酶活力的影響

a：POD; b：SOD

圖3-a 表示Ph-B組和Ph-C組Chla含量總體高于培養(yǎng)前期。Ph-B組在12 h含量最高為14.85 mg/L，Ph-C組在72 h含量最高為11.96 μg /L，Ph-B組在48 h顯著高于Ph-C組(P< 0.05)。藻膽蛋白是壇紫菜的主要光合色素，其品質(zhì)的好壞取決于藻膽蛋白含量的高低[14]，圖3-b、c、d表示在6、12、24、48和72 h中，壇紫菜葉狀體在加入附生菌后(Ph-B)，其含量均顯著高于Ph-C(P<0.05)，且48 h各藻膽蛋白RPE為6.46 mg/g、RPC 3.6 mg/g和APC 2.28 mg/g含量均達(dá)到最高，而Ph-C組藻膽蛋白最高含量RPE 3.59 mg/g、RPC 1.99 mg/g和APC 1.15 mg/g。Ph-B組的藻膽蛋白含量均高于培養(yǎng)前(0 h)，在6 h和12 h的Ph-C組RPE含量均低于0 h的含量，12 h時RPC和APC低于起始時間的含量，總體Ph-C組呈現(xiàn)下降又上升的趨勢。

圖3 芽孢桿菌對壇紫菜色素的影響

a：Chla；b：RPC；c：APC；d：RPE

總蛋白含量是評價紫菜營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)[14]。由圖4可知，Ph-B組和Ph-C組壇紫菜葉狀體總蛋白含量大體呈上升趨勢，在有附生菌存在的情況下，總蛋白含量在12、48和72 h均顯著高于Ph-C組(P<0.05)，Ph-B組含量高達(dá)36 mg/g，Ph-C組則為28 mg/g。

圖4 芽孢桿菌對壇紫菜總蛋白的影響

正常生長條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量很低， 但當(dāng)其處于逆境脅迫時含量可迅速增加, 通常情況下脯氨酸累積含量與植物的抗逆性呈正比關(guān)系[15]。藻體沒有附生菌時，在6 h、12 h、48 h和72 h時，Ph-C組游離脯氨酸含量顯著高于Ph-B組(P<0.05)，兩組脯氨酸含量均在12 h分別達(dá)到最大為81.41.26 μg/g和100.93 μg/g，但培養(yǎng)24 h時，兩組并無顯著性差異(P> 0.05)。隨著培養(yǎng)時間的增加，兩組脯氨酸含量均高于培養(yǎng)前(圖5)。

圖5 芽孢桿菌對壇紫菜游離脯氨酸的影響

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物，其含量可以衡量細(xì)胞膜脂損傷程度[15]。在適溫(20℃)條件下，Ph-B組和Ph-C組MDA含量發(fā)生了極顯著變化(P<0.01，圖6)，且Ph-B組在不同時間(12、24和72 h)水平下MDA含量均極顯著高于Ph-C組(P<0.01)，Ph-C組MDA含量在6和48 h時極顯著高于Ph-B組(P< 0.01)，其值高達(dá)209.53 nmoL/g。

圖6 芽孢桿菌對壇紫菜丙二醛的影響

3 討論

在適宜溫度下，海洋芽孢桿菌Bacillus有利于壇紫菜的生長，促進(jìn)了藻體內(nèi)總蛋白的積累，與壇紫菜形成互利共生的關(guān)系。植物體內(nèi)SOD和POD活性的提高能增強(qiáng)植物對多種氧化脅迫的抗性。在本研究中，在20℃培養(yǎng)條件下，Ph-B和Ph-C的SOD和POD并無顯著性差異(P>0.05)。這說明在適宜溫度下，壇紫菜葉狀體與細(xì)菌共培養(yǎng)并未對壇紫菜造成脅迫。作為衡量細(xì)胞膜脂損傷程度重要指標(biāo)的MDA含量在Ph-C中48 h出現(xiàn)極顯著增加現(xiàn)象(P<0.01)，且其含量209.53 μmol/g極高，遠(yuǎn)高于張元在21℃測量的耐高溫型與野生型壇紫菜MDA含量20～30 μmol/g[13]，因此無菌處理對紫菜細(xì)胞造成了一定的影響。同時，非酶促系統(tǒng)如脯氨酸等的含量在一定程度上可以判斷逆境對植物的危害程度和植物對逆境的抵抗力。在本研究中，紫菜葉狀體在與共附生菌共同培養(yǎng)條件下(Ph-B)，脯氨酸含量顯著低于Ph-C的壇紫菜(P<0.05)，符合壇紫菜代謝組測定的結(jié)果。在復(fù)雜的藻際微環(huán)境中，沒有了生物膜這層保護(hù)系統(tǒng)[16]，藻細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量隨即顯著上升，而到了培養(yǎng)后期，隨著細(xì)胞內(nèi)SOD含量的下降，脯氨酸含量也開始顯著下降(圖5)，說明脯氨酸在壇紫菜清除自由基以避免細(xì)胞損傷中也發(fā)揮了重要作用。

20℃下菌藻共培養(yǎng)，促進(jìn)了紫菜生長，增加了光合色素的含量。藻膽蛋白和葉綠素Chl a是壇紫菜主要的光合色素。其中，藻膽蛋白被認(rèn)為是藻類細(xì)胞中的主要氮源貯藏庫，在適宜的光照和溫度培養(yǎng)條件下，豐富的氮源有利于藻膽蛋白的合成，相反，在缺乏氮源的情況下，藻膽蛋白的合成明顯降低甚至停止[14]。有研究證實浮游生物硅藻Pseudonitzschiamultiseries優(yōu)先利用的N源是來自細(xì)菌Sulfitobacter(SA11)衍生的銨而不是外援添加的硝酸鹽[17]。本課題組前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：濃度為1.0×10-8～1.0×10-6mg/mL的附生真菌Cladosporiumsp.提取物N5能促進(jìn)壇紫菜葉狀體和絲狀體的生長以及藻膽蛋白的積累[9]。我們前期試驗表明芽孢桿菌WPySW2對壇紫菜葉狀體起到類似植物生長激素的作用，促進(jìn)其生長，與在本實驗結(jié)果一致。微藻中也報道過類似結(jié)果，微藻利用細(xì)菌產(chǎn)生的吲哚-3-乙酸、維生素B12來促進(jìn)自身生物量的增加[18]。細(xì)菌Bacillussp. WPySW2 是通過產(chǎn)生類似生長調(diào)節(jié)物質(zhì)還是通過為共養(yǎng)組壇紫菜提供氮源而促進(jìn)了壇紫菜的生長，有待進(jìn)一步探究。

相同溫度下，我們用核磁研究了芽孢桿菌胞內(nèi)代謝物，發(fā)現(xiàn)丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、核糖5-磷酸、尿嘧啶，還有乙酰胺、琥珀酸、甜菜堿含量顯著升高(未發(fā)表)。有研究表明，玫瑰桿菌對DOM、硫化物、脲、胺、?；撬?、甜菜堿和磷酸酯等化合物的利用，是為了與藻細(xì)胞維持的共生關(guān)系[3]?；蛟S，芽孢桿菌在維持穩(wěn)定的藻際環(huán)境中，有類似玫瑰桿菌的生態(tài)功能。但是，芽孢桿菌到底是通過哪種或哪類代謝物影響了壇紫菜的生理特征，二者之間如何進(jìn)行信號物質(zhì)的傳遞，有待深入研究。

壇紫菜的養(yǎng)殖和病害防治已經(jīng)成為如今的一項熱門研究，芽孢桿菌作為壇紫菜的藻際附生菌，通過研究芽孢桿菌對壇紫菜生長、光合作用的影響，分析其中的規(guī)律，可以很好地指導(dǎo)在養(yǎng)殖業(yè)中利用芽孢桿菌進(jìn)行壇紫菜的健康養(yǎng)殖。在適宜溫度下芽孢桿菌對壇紫菜的生理特性影響的研究中，由此得出結(jié)論：在適宜溫度(20℃)下，芽孢桿菌能促進(jìn)壇紫菜的生長和光合作用，附生菌能為藻體提供生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，為穩(wěn)定的藻際環(huán)境提供必要條件。但是，不同環(huán)境下的藻際細(xì)菌的生態(tài)功能，有待進(jìn)一步研究。

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